Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
25—196
386
Глава 5
поэтому, даже оказавшись в .таком хромосомном окружении* которое ограничит его экспрессию лишь некоторыми клеточными типами, он все равно обеспечит развитие гу+-окраски глаз. Наконец, следует упомянуть о том, что существуют хорошие балансёры третьей хромосомы, такие, как ТМЗ [8, 15], которые несут fMS-индуцированные гу-аллели и поэтому особенно удобны для характеристики трансформантов и балансирования хромосом с интегрированными элементами (о балансёрах и их использовании в экспериментальной практике более подробно говорится в разд. 7.1).
Один из недостатков rosy как маркера транспозонов связан с тем, что 7,3 т. п. н-фрагмент расщепляется большинством рестрикционных эндонуклеаз, узнающих гексануклеотидные последовательности (исключения составляют, в частности, Sailv Hpal и Kpnl). Это создает известные трудности в манипулировании с плазмидами, несущими ген гу. Кроме того, сам ген, его транскрипт и регуляторные последовательности еще недостаточно полно охарактеризованы.
3.2.2. Ген алкогольдегидрогеназы (Adh)
Ген Adh (хромосома 2L, локус 50,1) клонирован и хороша изучен [19—21]. Подобно rosy, это один из первых генов, успешно транспозированных в геном дрозофилы [9]. Известны многочисленные мутанты Adh~, которые могут служить реципиентными линиями. Мутантный фенотип проявляется в повышенной чувствительности к этанолу: 6%-ный раствор этанола токсичен для Adh~-Myx, тогда как единственный аллель дикого* типа способен обеспечить их совершенную защиту. Таким образом, можно проводить селекцию трансформантов на среде, содержащей этанол, и не заниматься индивидуальным отбором потомков, что заметно экономит время. Известны хорошие балансёры второй хромосомы, например СуО, несущие аллель Adh~ [9]. Функциональный ген локализуется в 3,5 т.п.н.-Xbal-фрагменте, который не содержит участков узнавания для рест-риктаз ?coRI, SacI, Bglll и Pvul, что делает этот маркер достаточно удобным для генно-инженерных манипуляций.
В то же время ген Adh не имеет внешнего фенотипического* проявления, поэтому приходится тратить больше усилий на дальнейшее картирование и скрещивание Adh-трансформантов^ Кроме того, селекция по устойчивости к этанолу может привести к утрате трансформантов с пониженной активностью гена Adh.
3.2.3. Устойчивость к неомицину
В настоящее время в распоряжении исследователей появились и многие другие генетические маркеры. Каждый новый ген, который удается клонировать и затем обратно ввести в ге-
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы
387
ном дрозофилы, становится потенциальным маркером и в принципе может быть использован в дальнейших экспериментах по генетическому переносу. Не так давно был сконструирован вектор на основе P-элемента, который несет бактериальный ген неомициновой устойчивости (neoR), поставленный под контроль промотора гена белка теплового шока дрозофилы [11]. Трансформанты, в геноме которых присутствует этот элемент, приобретают устойчивость к препарату G418 при его концентрации в пище 1 мг/мл; в норме этот препарат токсичен для личинок мух. Указанный маркер транспозонов имеет то очевидное преимущество, что обеспечивает экспрессию селективного признака практически на любом генетическом фоне, включая и дикий тип. Следовательно, реципиентная линия мух может не нести никаких специальных мутаций, однако здесь мы сталкиваемся с такими же ограничениями, что и в случае Adh. Трансформанты с низким уровнем экспрессии гена могут быть потеряны при селекции, а дальнейшие манипуляции с трансформантами, основывающиеся на особенностях их фенотипа, предполагают использование химических средств, а не простого визуального контроля.
Если ставится задача отбора трансформантов, экспрессирующих транспозированные гены на «нормальном» уровне, вероятно, имеет смысл использовать маркеры, обеспечивающие трансформантам устойчивость к различным химическим агентам,— такие, как Adh или neoR. С другой стороны, если интерес представляет каждый трансформант, включая и такие особи, которые экспрессируют введенный ген с теми или иными «искажениями» (например, благодаря эффекту положения), целесообразно использовать в качестве маркера ген rosy.
3.3. Векторы на основе Р-элементов
Выбрав подходящий генетический маркер, исследователь приступает к следующему этапу работы — клонированию интересующего гена в векторной плазмиде, сконструированной на базе P-элемента. Подобные векторы являются производными дефектных P-элементов, клонированных в бактериальных векторах. Они сохраняют все нуклеотидные последовательности, необходимые для транспозиции, а также несут дополнительные рестрикционные сайты, позволяющие вводить интересующие фрагменты ДНК в состав транспозона (т. е. в область, ограниченную обращенными повторами). Дис-функциональные последовательности, необходимые для придания P-элементу транспозиционной компетентности, охарактеризованы пока недостаточно полно. Эти зоны действительно включают инвертированные повторы, однако не исключено, что они распространяются и за их пределы, по крайней мере на левом фланге [см. 16]. Еще не
