Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2.3. P-элементы и трансформация клеток зародышевого пути
Функциональная целостность P-элемента длиной 2,9 т. п. н. и его способность трансформировать клетки зародышевого пути' были прямо продемонстрированы Спрадлингом и Рубином [2]. Эти авторы предположили, что введение клонированного интакт--ного P-элемента в зародышевые клетки развивающегося эмб~
384
Глава 5
риона М-линии имитирует условия гибридного дисгенеза, когда P-элементы, присутствующие в геноме сперматозоидов, внезапно оказываются в клеточной среде М-цитотипа. Было показано, что 2,9 т. п. н.-элемент (находящийся в составе бактериальной плазмиды) может транспозироваться из плазмиды в хромосом, ную ДНК клеток зародышевого пути мух. Для того чтобы проверить предположение о том, что транспозаза, кодируемая „ин-тактным, автономным P-элементом, способна обеспечить перемещение и дефектного элемента, авторы повторили описанный эксперимент, осуществив совместную инъекцию полного (2,9 т. п. н.) элемента и дефектной копии, в которую с помощью генно-инженерных манипуляций был предварительно встроен ген дикого типа rosy (гу) — структурный ген ксантиндегидро-геназы, одного из ферментов биосинтетического пути пигментов глаза. Эмбрионы, в которых вводили эту смесь дефектных и недефектных P-элементов, были гомозиготными мутантами по гену гу. Часть потомства, полученного от подвергнутых инъекции мух, имела фенотип rosy+. В дальнейшем было показано, что их ;геном содержит стабильно интегрированные Р[гауг/]-транспо-зоны. Плазмидных последовательностей, которые были бы ассоциированы с интегрированными транспозонами, обнаружено не было. Это свидетельствует в пользу предположения, что транспозиция P-элементов осуществляется при участии обращенных концевых повторов.
3. Планирование экспериментов по трансформации
3.1. Необходимость генетического маркера
Можно смело утверждать, что наличие фенотипически различимого селективного маркера, кодируемого транспозируемой ДНК, — необходимое условие успешной работы. Если бы Рубин и Спрадлинг исследовали потомство своих мух на предмет интегрированных P-элементов методом блот-гибридизации ДНК, им вряд ли удалось бы выявить трансформантов. В действительности эти авторы проводили селекцию трансформантов на основе фенотипических изменений, обусловленных экспрессией новых генов, привнесенных в геном в составе P-элементов. Это позволило им обнаруживать трансформантов даже в тех случаях, когда их доля в потомстве подвергнутых инъекции мух составляла менее 0,5% [11-
Исследователю следует прежде всего решить, какой маркер должен нести фрагмент ДНК, предназначенный для генетического переноса, — скажем, экспрессирующий какой-нибудь примечательный фенотип или же определенный селективный признак. Если исследуемый фрагмент ДНК сам по себе кодирует подобные функции, прямой отбор трансформантов не представ*
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы
385
ляет трудности. Может, однако, возникнуть задача изучения измененного гена или только части гена (например, промоторной области), когда экспрессия инъецированной ДНК не гарантируется или же интересующая последовательность не детерминирует примечательный фенотип. Тогда исследуемый фрагмент ДНК соединяют в составе одной молекулы с геном, экспрессирующим примечательный фенотип или селективный признак. Любой ген, который, будучи представлен в одной дозе, обеспечивает экспрессию соответствующих функций (т. е. доминантный аллель), может служить маркером для трансформации. При работе с гомозиготными мутантами эту роль может играть ген дикого типа. Наиболее широко в качестве маркеров для трансформации используются два гена — это структурные гены алкогольдегидрогеназы (Adh) и rosy (гу). Позже для этой цели стали с успехом использовать бактериальный ген лекарственной устойчивости neoR, состыкованный с промотором из генома дрозофилы [11]. Каждый из этих маркеров имеет свои достоинства и недостатки, о чем мы расскажем ниже.
3.2. Маркеры для трансформации
3.2.1. Ген rosy (структурный ген ксантиндегидрогеназы)
Ген rosy (гу, хромосома 3R, локус 52,0) был клонирован Бендером с сотр. [17]. Это первый ген, который удалось ввести в геном дрозофилы с помощью P-зависимой транспозиции; сейчас это один из наиболее распространенных маркеров, используемых при различных генетических манипуляциях. Мухи-реципиенты могут быть гомозиготными по любой из нескольких известных п/-мутаций, например гг/42 (эти линии, а также большинство других стандартных линий мух описаны в работе Линдсли и Грелла [18]). Эти мухи имеют коричнево-красные, почти коричневые глаза, что позволяет при небольшом увеличении легко отличать их от мух дикого типа, с глазами кирпично-красного цвета. Р [гу] -элемент, содержащий ген rosy в составе 7,3 т. п. н.-ЯшШП-фрагмента ДНК, обусловливает развитие у мух-трансформантов глаз, окрашенных по дикому типу. Даже весьма низкая функциональная активность гена гу (1— 5% от нормальной активности гена дикого типа) способна обеспечить появление видимых фенотипических изменений у гу~-му-тантов: цвет глаз у таких мух становится близким к цвету глаз мух дикого типа. Таким образом, даже в том случае, если Р[гг/]-элемент внедрится в неблагоприятную с точки зрения трансформации область генома (например, в гетерохроматиновый участок), особь, несущая этот элемент, будет идентифицирована как трансформант. Кроме того, экспрессия гена гу в любых клетках влияет на формирование глазных пигментов,
