Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2. Принцип метода
Процедура трансформации базируется на свойствах Р-эле-ментов и их поведении в условиях гибридного дисгенеза.
2.1. P-элементы и гибридный дисгенез
Мы ограничимся лишь самым поверхностным описанием P-элементов и их роли в гибридном дисгенезе. Для более подробного ознакомления с предметом отсылаем читателя к двум прекрасным обзорам [12, 13].
-382
Глава 5
Термином «Р-М гибридный дисгенез» называют синдром коррелирующих генетических аберраций, который наблюдается у потомства Fi (так называемых дисгенных гибридов), полученного от скрещивания самцов определенных линий Drosophila (называемых P-линиями) с самками некоторых других линий (так называемых М-линий). Отмеченные аберрации включают стерильность, повышенную частоту мутаций, хромосомные перестройки и рекомбинацию у самцов. Примечательно, что они возникают почти исключительно в клетках зародышевого пути мух Fj.
P-элементы являются медиаторами гибридного дисгенеза. В совокупности они представляют собой семейство мобильных генетических элементов, которые присутствуют во всех Р-лини-ях мух и отсутствуют в большинстве (но не во всех) М-линий. Существует два больших класса P-элементов: недефектные и
дефектные. Недефектные P-элементы, вероятно, кодируют по меньшей мере два функционально активных белка — транспо-зазу, необходимую для их собственной транспозиции и транспозиции дефектных элементов, и фактор, ограничивающий транспозицию P-элементов, называемый обычно фактором, определяющим цитотип. Когда P-элементы находятся в стабильном состоянии, говорят о Р-цитотипе — это по сути клеточная среда P-линий мух. Природа Р-цитотипа неизвестна; можно предполагать, что в этих клетках присутствует некий репрессор, скажем аналогичный репрессору бактериофага лямбда. При оплодотворении функциональные P-элементы, присутствующие в геноме сперматозоидов, попадают в ядра яйцеклеток М-цито-типа (это клеточная среда М-линии мух, характеризующаяся отсутствием функциональных Р-элементов). Здесь они дестабилизируются и мобилизуются для транспозиции, подобно тому как при зиготной индукции лямбда-профаг внезапно дерепрес-сируется, попадая в бактериальную клетку, не содержащую репрессора. В норме описанные события происходят при скрещивании самцов P-линий с самками М-линий (дисгенное скрещивание). При реципрокном скрещивании (самцов М-линий и самок P-линий) или скрещивании РхР P-элемент остается «привязанным» к Р-цитотипу яйцеклетки и феномен гибридного дисгенеза не проявляется. Закономерности наследования и экспрессии цитотипов представляют большой интерес, однако эта тема выходит за рамки нашего обзора.
2.2. Структура Р-элементов
О’Хар и Рубин [14] клонировали и определили первичную структуру нескольких Р-элементов. Все P-элементы были разделены ими на два класса: большие — длиной 2,9 т. п. н. (неде-«фектные автономно реплицирующиеся элементы) и малые — дли-
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы
38Ф
ORFO
Hindlll
А
Xhol ___I___
ORFI
Hind III
___I_______
ORFII
EcoRI
i
GRFIII
Sail
Hindlll
Xhol Hindlll ___l_______I______
EcoRI
i
Sail
Hindlll В -----------
Полилинкер ______I_____.
Hind III Г ------------
Hpal Sail
....
rosy
Рис. 1. Схематическое изображение структуры P-элементов, используемых в экспериментах по трансформации. А. Интактный автономный элемент длиной' 2,9 т.п.н., присутствующий в плазмиде ря25,1 [14]; сверху показаны четыре открытые рамки считывания (ORF), а также основные рестрикционные сайты. Б. P-элемент из плазмиды ря 25,7 wc. Обратите внимание на делецию области правого инвертированного повтора. В. Обобщенная структура векторов на основе P-элемента серии Carnegie; показано расположение участка клонирования, содержащего уникальные рестрикционные сайты. Г. Вектор Carnegie 20,. содержащий селективный маркер (ген rosy) и несколько уникальных рестрикционных сайтов для клонирования желаемого фрагмента ДНК.
ной 0,5—1,6 т.п.н. (дефектные элементы, которые, по-видимо-му, произошли от полных элементов за счет утраты части внутренних последовательностей). 2,9 т. п. н.-элементы имеют 4 большие открытые рамки считывания в одной изцепей( рис. 1)„ которые, как предполагают, кодируют единственный полипептид, обладающий транспозазной активностью [15]. Элемент фланкирован обращенными повторами длиной в 31 нуклеотид;, для транспозиции элемента необходимо присутствие обоих концевых повторов в интактном виде [15, 16]. Малые, дефектные P-элементы утратили часть нуклеотидных последовательностей,, принадлежащих открытым рамкам, и, следовательно, не могут-кодировать транспозазу. Однако эти элементы сохранили инвертированные концевые повторы, благодаря чему они также способны перемещаться по геному, используя транспозазу, синтез которой обеспечивается полным 2,9 т. п. н.-элементом.
