Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
6. Перспективы на будущее
В настоящее время главным препятствием на пути исполь-
зования генетической инженерии растений для улучшения качества сельскохозяйственных культур является относительно слабая разработка систем культивирования растительных тканей и .регенерации растений. Кроме того, остается нерешенной пробле-
378
Глава 4
Таблица 31. Определение дигидрофолатредуктазы
1. Инкубируйте 5 г растительной ткани в 5 мл не содержащей фосфата среды MSO (в случае опс+-ткани) или MSP1 (в случае one--ткани) (см. табл. 9) в присутствии ОД мг/мл метотрексата (Sigma) при 25 °С в течение 22 ч в темноте, используя ротационную качалку (мягкий режим)
2. Удалите среду и замените ее свежей средой, содержащей метотрексат и 35 мкКи [32Р] ортофосфата (Amersham). Продолжайте инкубацию в течение еще 22 ч.
3. Удалите среду, промойте ткань три раза в 15 мл фосфатного буфера и заморозьте в жидком азоте.
4. Гомогенизируйте ткань в 0,5—1,0 мл раствора: 50 мМ. NaCl; 10 MAi ЭДТА; 1% саркозил; 10 мМ трис-НС1 pH 7,5. Затем гомогенат экстрагируйте дважды фенолом.
5. Осадите нуклеиновые кислоты изопропанолом и ресуспендируйте ft 50 мкл буфера для ДНК (10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 0,1 мМ ЭДТА; 5 мМ NaCl), содержащего 20 мкг/мл РНКазы.
6. Инкубируйте 1 ч при 37 °С, добавьте 450 мкл раствора протеина-зы К (200 мкг/мл) в 0,10 SDS и инкубируйте еще в течение 1 ч.
7. Экстрагируйте смесь дважды фенолом и осадите изопропанолом. Затем ресуспендируйте осадок в 50 мкл буфера для ДНК и проведите электрофорез образца в 1%-ном агарозном геле.
8. Окрасьте гель этидиумбромидом и сфотографируйте, чтобы зафиксировать картину фракционирования растительной ДНК2). Затем экспонируйте с гелем рентгеновскую пленку; радиоавтограф покажет включение 32Р в ДНК.
‘) В качестве контрольных образцов используйте иеинфицироваиную ткаиь, инкубируя ее в присутствии метотрексата н без него (чтобы показать ингибирование синтеза. ДНК), а также инфицированную растительную ткаиь при такой же постановке эксперимента.
2) Относительная интенсивность полос ДНК может служить в качестве приблизительной оценки количества ДНК, полученного из той или иной растительной тканн. Более точное количественное определение ДНК проводят с помощью дифеииламинового теста (табл. 24).
ма обеспечения стабильной интеграции и экспрессии чужеродных генов на нужной стадии развития. Здесь требуется дальнейшее углубленное изучение растительных промоторов.
Следует отметить также и то, что мы пока не можем однозначно определить, какие гены следует клонировать и использовать для направленного изменения свойств сельскохозяйственных растений. Сейчас мы ограничиваемся отдельными генами,, кодирующими запасные белки (возможно, с их помощью удастся улучшить качество растительного белка) или ферменты, способные расщеплять гербициды. Такие сложные, свойственные растениям функциональные особенности, как солевая устойчивость или образование клубеньков (у азотфиксирующих видов), познаны нами далеко не полностью, так что пока мы не можем выделить ген или, что более вероятно, генный кластер,, кодирующий эти функции, и перенести соответствующую генетическую информацию в клетки растения другого вида. Нам также еще предстоит понять молекулярные основы взаимоотношений хозяина и патогена, прежде чем мы сможет оперировать
Генетическая инженерия растений
379
генами, ответственными за устойчивость к инфекционным агентам.
В ряде случаев улучшение хозяйственных характеристик растений может осуществляться за счет удаления определенных генов, которые снижают урожай, воздействуя на процесс биосинтеза белка. Поскольку не всегда существует возможность селекции таких мутантов или отбора вариантов на уровне культуры ткани, представляется заманчивой возможность заменять соответствующие аллели дикого типа на клонированные мутантные аллели с использованием трансформации и гомологичной рекомбинации.
Благодарности
Мы благодарим Энн Депикер, приславшую нам модернизированную методику определения опинсинтаз и методические разработки экспериментов Джентской (Gent) лаборатории по коинфицированию. Мы признательны Крису Смиту за предоставление методики очистки РНК, Эрику Вьемеру, принявшему участие в разработке аналитического метода выделения Ti-плаз-мидной ДНК, Луису Эррера-Эстрелья, предоставившему неопубликованную рестрикционную карту pLGVneoll03, и ЮрекуПаш-ковскому, разработавшему метод определения NPT в применении к растительным тканям. В заключение мы благодарим Глина Милхауза, выполнившего фотографические работы, и Элен Розье за перепечатку рукописи.
Литература
1. Kosuge Т., Meredith С. P., Hollaender A. (eds.). Genetic Engineering of Plants: An Agricultural Perspective, published by Plenum Press, New York, 1983.
'2. Caplan A., Herrera-Estrella L., I me D., Van Haute E., Van Montagu М., Schell }., Zambryski P. Science (Wash.), 222, 815 (1983).
3. Akiyoshi D. E., Klee H., Amasino R. М., Nester E. W., Gurdon M. P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5994 (1984).
