Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Относительно недавно разработан новый ускоренный метод качественного и количественного определения малых количеств NPT в грубых клеточных экстрактах [41]. Метод основывается на электрофоретическом отделении фермента от других белков и определении его активности по фосфорилированию in situ антибиотика канамицина. Канамицин и [а-32Р] АТР — субстраты NPT — вводят в агарозный гель, в который диффундируют фракционированные белки. Образующийся в результате энзиматической реакции фосфорилированный канамицин переносится на фосфоцеллюлозную ионообменную бумагу Р81 и визуализируется по радиоактивной метке с помощью радиоавтографии. Описанный метод позволяет детектировать 1 нг активного фермента как в прокариотических, так и в эукариотических источниках; кроме того, он может продемонстрировать различия в размерах белков, обладающих данной ферментативной активностью. Подробно метод изложен в табл. 30.
5.4. Определение дигидрофолатредуктазы
Не так давно появилось сообщение о том, что вирус мозаики цветной капусты (CaMV) может служить вектором для введения небольших фрагментов ДНК в растительные клетки [42]. Две области генома CaMV — открытые рамки считывания (CORFs) II и VII, — по всей видимости, не играют существенной роли в инфекционности вируса. Поэтому Бриссон с сотр. [42] заместили CaMV ORF II плазмидным геном дигидрофолатредуктазы (dhfr), который обеспечивает устойчивость Е. co-
li к триметоприму, а у эукариотических клеток — к метотрексату. Гибридная вирусная ДНК устойчиво воспроизводилась в клетках репы, причем ген dhfr экспрессировался в виде функционального фермента. Наличие соответствующей ферментативной активности было продемонстрировано с помощью изящного теста (табл. 31), основанного на включении 32Р в ДНК в присутствии метотрексата.
Генетическая инженерия растений
377
Таблица 30. Определение неомицинфосфотрансферазы
: 1. Проэкстрагируйте 100 мг растительной ткани 20 мкл буфера А1',
.растерев образец в микроцентрифужной пробирке2).
2. Добавьте 1/10 объема экстракта ткани корончатого галла (1 г ткани в 350 мкл буфера В3), инкубация при 4°С в течение 1 ч.).
3. Центрифугируйте, чтобы удалить твердые частицы, добавьте бромфе--ноловый синий до 0,002% и нанесите на 10%-ный неденатурирующий полиакриламидный гель4) (по 40 мкл в лунку). Так как фермент движется в д-еле недалеко от фронта красителя, следите за тем, чтобы краситель не вышел из геля.
/ . 4. По окончании электрофореза дважды промойте гель водой и уравновесьте буфером О5).
5. Перенесите гель в стеклянную кювету и залейте 1,5 мм слоем 1%-ной •агарозы, содержащей канамицинсульфат и [а-32Р] АТРб). Инкубируйте при гкомнатной температуре в течение 30 мин.
6. Положите поверх геля один лнст бумаги Whatman Р81, затем 2 листа .Whatman ЗММ и стопку фильтровальной бумаги. Перенос длится 1—3 ч.
7. Отделите от стопки лист Р81, тщательно удалите приставшие частицы агарозного геля и промойте 5 раз по 5 мин в горячей воде (80—90°).
8. Оберните этот лист Р81 упаковочной пленкой «Cling Film» или «Saranwrap» и экспонируйте на рентгеновскую пленку, используя усилива-.ющие экраны. Время экспозиции — от нескольких часов до недели при —70 °С.
¦) Буфер А: 40 мМ ЭДТА; 150 NaCl; 100 мМ NH4C1; 10 мМ трнс-НС1 pH 7,5; 2,31 мг/мл ДТТ; 0,12 мг/мл лейпептииа; 0,21 мг/мл ингибитора трипсина.
2) Не забудьте поставить контрольные реакции с неннфицнроваиным растением и с экстрактом из Е. coli, содержащим NPT. Экстракт из Е. coli получают так. Выращивают клетки в 20 мл среды LB до титра 4Х108/мл, центрифугируют и ресуспеиднруют в 50 мкл буфера А. «Озвучивают» клетки, чтобы получить грубый экстракт, и сиова центрифугируют, чтобы удалить клеточные обломки. Перед нанесением на гель надосадочную жидкость в различных разведениях (в буфере А) добавляют к экстракту ткани корончатых галлов в буфере В. Окрашивание кумассн голубым недеиатурирующего полиакриламидного геля, содержащего экстракт Е. coli и известные стандарты, позволяет оценить количество NPT в экстракте.
3) Буфер Б': 30 мМ NaCl; 15 мМ NH4C1; 3 мМ MgCl2; 5 мкМ ЭДТА; 3 мМ трис-НС1 pH 7,5; 0,031 мг/мл ДТТ; 36 мг/мл сахарозы.
*) 10%-ный неденатурирующнй гель приготавливают из следующих компонентов. А. Разделяющий гель: 10 мл 30%-иого акриламид/бнсакриламида (29; 1); 12,2 мл Н20; 7,5 мл 1,5 М трис-НС1 pH 8,8; 10 мкл TEMED; 200 мкл 10%-ного персульфата аммония. Б. Концентрирующий гель: 1,5 мл 30%-ного акриламид/бнсакриламида (29 ; 1); 1,25 мл 1 М трис-НС1 pH 6,8; 7 мл НзО; 10 мкл TEMED; 30 мкл 10%-иого персульфата аммония. 50Хэлектрофорезный буфер приготавливают, растворяя 288 г глицина н 60 г триса в 400 мл воды.
5) Буфер С: 67 мМ трис-малат pH 7,1; 42 мМ MgCl2; 400 мМ NH4C1.
в) Агарозный гель для наслаивания готовят следующим образом: смешивают при 45 °С 15 мл буфера С, 15 мл расплавленной (45 °С) 2%-ной водной агарозы, 100 мкКи 1а-32Р] АТР (5—7000 Ки/мМ), 40 мкл канамнцинсульфата (25 мг/мл). Этого количества достаточно для наслаивания на гель площадью 200 см2. Использование для электрофореза полиакриламидных блоков большей площади требует пропорционального увеличения количества агарозного геля. Добавление более 50 мкл раствора канамнцинсульфата не повышает чувствительности метода, тогда как увеличение содержания АТР увеличивает чувствительность.
