Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2) Буфер для определения OCS. 200 мМ фосфат натрия pH 6,8, 30 мМ аргинин-НС1;
75 мМ нируват натрия; 20 мМ NADH. Этот раствор готовят по частям следующим обра-
зом. Сначала делают буфер RXO, который хранят в замороженном состоянии (250 мМ фосфат натрия pH 6,8; 40 мМ аргиннн-НС1; 100 мМ пируват натрия). Для приготовления полного OCS-буфера 75 мл RXO смешивают с 10 мл 200 мМ раствора NADH в 15 мл воды. Раствор NADH готовят непосредственно перед использованием из сухого вещества,, хранящегося при —20 °С. Приготовьте небольшое количество 200 мМ водного раствора NADH и определите спектрофотометрически реальную концентрацию (1 М NaDH обусловливает ОПз40 = 6220). Скорректируйте объем с учетом обнаруженной погрешности.
3) Буфер для определения NOS: 200 мМ фосфат натрия pH 6,8; 60 мМ аргинин-НС1;
60 мМ а-кетоглутарат; 16 мМ NADH. Сначала готовят буфер RXN: 250 мМ фосфат нат-
рия pH 6,8; 80 мМ аргинин-НС1; 80 мМ а-кетоглутарат. Затем смешивают 75 мл буфера RXN, 8 мл 200 мМ NADH и 17 мл воды.
4) Можно использовать любой из трех буферов для электрофореза: а) 15% уксусная кислота; 5% НСООН, pH 1,8 (иопалин локализуется вблизи старта у положительного полюса,’ затем — октопин и аргинин); б) 50 мМ Na2B407 pH 9,2 (октопин и нопалин хорошо разделяются, но октопин может мигрировать вместе с некоторыми растительными компонентами. Расположение пятен такое же, как в первой системе); в) 50 мМ цитрат натрия pH 5,0 (октопин также может плохо отделяться от загрязнений. Порядок расположения пятен относительно старта у положительного полюса следующий: октопин — ио-палии — аргинин).
) Красящий раствор готовят из двух компонентов, которые можно хранить при —20 °С: 0,02%-ный фенантрехинон в 95%-ном этаноле и 10%-ный NaOH в 60%-ном этаноле. Равные объемы этих растворов смешивают и используют в течение 1—2 ч. Фенан-трехипон очень токсичен — работайте под тягой!
приведен альтернативный метод, в основу которого положено наблюдение, что лимитирующим звеном описанных реакций, по-видимому, являются пируват и а-кетоглутарат, а не аргинин. Этот метод вместо определения ферментативной активности в
Генетическая инженерия растений
375
грубом экстракте позволяет выявлять накопление опинов в ин-тактной ткани.
1. Поместите небольшое количество ткани (приблизительно
10 мг) в микроцентрифужную пробирку и добавьте 35—50 мкл среды культивирования (так, чтобы примерно половина всей ткани была покрыта жидкостью, а половина осталась на воздухе). В качестве среды культивирования для анализа опс+-тка-ни используют среду MSO (табл. 9), в которую добавлен аргинин до концентрации 10 мМ и либо пируват до 10 мМ (определение OCS), либо а-кетоглутарат до 10 мМ (определение NOS). Для анализа опс~-ткани используют среду MSP1.
2. Инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре.
3. Удалите среду культивирования, подсушите ткань на фильтровальной бумаге и перенесите ее в чистую пробирку.
4. Заморозьте ткань и выдержите 10 мин при —20 °С, чтобы облегчить ее измельчение. Затем измельчите ткань и центрифугируйте в микроцентрифуге в течение 5 мин.
5. Далее продолжайте эксперимент, начиная со стадии 4, табл. 29.
Этот метод столь же надежен и чувствителен, как и определение ферментативной активности, а растительная среда может храниться при 4 °С в течение месяца.
5.2. Определение хлорамфениколацетилтрансферазы
Этот аналитический метод широко используется в экспериментах, связанных с трансформацией клеток млекопитающих, и подробно описан в гл. 6 настоящего тома. Коротко он заключается в следующем.
1. 100 мг трансформированной ткани растирают в микро-центрифужной пробирке стеклянной палочкой в 100 мкл буфера, содержащего 500 мМ сахарозу; 250 мМ трис-НС1 pH 7,5; 1% аскорбиновую кислоту; 0,5 мМ лейпептин (Sigma); 10 мМ ЭДТА; 1% цистеин-НС1, 0,5 мМ ацетил СоА и 1 мкКи [14С] хлорамфеникола (50 мкКи/мМ”1, NEN).
2. Инкубируют при 37 °С в течение 30 мин и затем центрифугируют в микроцентрифуге в течение 10 мин. Хорошим положительным контролем здесь может служить обработанный ультразвуком экстракт Е. coli, несущий pBR325 и, следовательно, ген cat.
3. Экстрагируют реакционую смесь этилацетатом и затем концентрируют упариванием.
4. Проводят распределительную хроматографию экстракта в тонком слое силикагеля в системе хлороформ: метанол (95:5), позволяющей разделить ацетилированную и неацетилированную формы хлорамфеникола. Визуализацию хроматограмм осуществляют путем радиоавтографии.
376
Глава 4
5.3. Определение неомицинфосфотрансферазы
Ген nptll широко используется в качестве селективного доминантного маркера, позволяющего отбирать трансформированные растительные клетки по их устойчивости к канамицину. С помощью гель-фильтрации высокого разрешения грубых растительных экстрактов Эррера-Эстрелья с сотр. [7] показали, что трансформированные растительные ткани, обнаруживающие устойчивость к канамицину, действительно содержат фермент, который способен фосфорилировать канамицин и имеет такой же профиль элюции, как фермент, присутствующий в контрольном экстракте из Е. coli, несущей ген nptll knT.
