Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Эукариотическую МРНК можно отделить от других видов РНК, присутствующих в препарате суммарной РНК, с помощью аффинной хроматографии — благодаря наличию у этих молекул на З'-конце poly (А)-«хвоста» длиной 20—250 нуклеотидов. Для этих целей обычно используют oligo(dT)-целлюлозу или poly (и)-Сефарозу (коммерческие препараты). Активными элементами здесь являются 10—20-членные тимидиловые или ури-диловые олигомеры, которые способны гибридизоваться с по-лиадениловыми цепями, если их длина составляет хотя бы 10—15 нуклеотидов; этим обеспечивается связывание poly (А)-содержащих РНК на колонках с указанными аффинными сорбентами в условиях высокой ионной силы. Рибосомная РНК и
Генетическая инженерия растений
369-
Таблица 27. Получение суммарной растительной РНК
1. Приготовьте навески (приблизительно 5 г) свежего растительного материала и немедленно заморозьте в жидком азоте. Храните в нем до использования.
2. Одну-две навески замороженных листьев (5—10 г) разотрите в тонкую пудру в ступке, охлажденной жидким азотом. Периодически подливайте жидкий азот, чтобы ткань оставалась в замороженном состоянии.
3. Добавьте 50 мл буфера для гомогенизации1*. Быстро разотрите материал, пока буфер оттаивает, и немедленно продавите суспензию через
4 слоя стерильного муслина (автоклавированного) в коническую колбу на 250 мл.
4. Перенесите гомогенат в стерильные пробирки Согех (объемом 30 мл) и центрифугируйте при 8000 g в течение 10 мин при 4°С (ротор 8X50 мл).
5. Отберите надосадочную жидкость и профильтруйте ее через 4 слоя стерильного муслина в коническую колбу на 250 мл.
6. Добавьте 1/20 объема 10%-ного раствора SDS (конечная концентрация 0,5%).
7. Внесите равный объем водонасыщенного фенола, равный объем смеси хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) и поставьте на магнитную мешалку на 20 мин при комнатной температуре. Скорость перемешивания должна быть минимально достаточной для эмульгирования смеси.
8. Перенесите эмульсию в 50 мл центрифужные пробирки Ругех и центрифугируйте в настольной центрифуге при 2500 g в течение 10 мин. Денатурированные белки сформируют интерфазу между органическим и водным слоями.
9. Отберите верхний (водный) слой и интерфазу в чистую 250 мл колбу и добавьте равный объем хлороформа. Перемешивайте в течение 10 мин, разделите фазы центрифугированием и отберите только водную фазу.
10. Повторяйте экстракцию хлороформом, пока белковая интерфаза не станет едва заметной (обычно достаточно одного цикла). Стараясь не захватить частиц интерфазы, отберите водную фазу в стерильные 30 мл пробирки Согех. Добавьте 1/20 объема 3 М ацетата натрия и осадите нуклеиновые кислоты двумя объемами этанола при —20 °С в течение ночи.
11. Центрифугируйте при 8000 об/мин в течение 20 мин при 4 °С в роторе 8x50 мл Sorvall SS34 (или эквивалентном).
12. Промойте осадок нуклеиновых кислот дважды 1—2 мл 3 М ацетата натрия pH 6,0 при 4°С (на льду), чтобы удалить этанол и ДНК-
13. Промойте осадок дважды 80%-ным этанолом, содержащим 0,1 М ацетата калия, и храните в этом же растворе при —20 °С. Количество РНК можно определить спектрофотометрически, предварительно высушив осадок и растворив его в дистиллированной воде. Оптическую плотность полученного раствора следует измерять при 260 нм (1 ОП2бо=40 мкг/мл5>).
‘) Буфер для гомогенизации: 0,2 М трис-НС1 pH 8,5; 0,2 М сахароза (свободная от РНКаз); 30 мМ ацетат магния; 60 мМ КС1. Раствор автоклавируют и хранят в жидком виде или замораживают при —20 °С. Перед использованием добавляют поливинилпиро-лидон до 1% и 2-меркаптоэтаиол до 0,31% (по объему).
2) Чистоту препарата можно оценить спектрофотометрически, сняв спектр поглощения в УФ-свете: для чистой РНК — отношение ОПко ОП2бо=2,0.
тРНК не связываются с poly (U)-Сефарозой и oligo(dT)-целлюлозой и отмываются с колонки. Связанную мРНК затем элюируют низкосолевыми буферами. Процедура обогащения препарата РНК фракцией ро1у(А)+РНК описана в табл. 28.
Хорошим тестом на качество препарата РНК может служить его транслирование in vitro в бесклеточной белок-синтезирую-
24—196
Таблица 28. Получение poly(A)+PHK
1. 25 г oligo(dT)-целлюлозы (Sigma) поставьте набухать в стерильном буфере для нанесения РНК1' при комнатной температуре.
2. Набейте в узкую часть стерильной силиконированной пастеровской пипетки небольшое количество стерильной силиконированной стекловаты. Заполните пипетку oligo(dT) целлюлозой (примерно 1 мл). В качестве грубой оценки можно принять, что 1,0 г oligo (dT) -целлюлозы связывает из раствора 20—40 оптических единиц (при 260 нм) poly (А)+мРНК, т. е. 0,8— 1,6 мг РНК.
3. Промойте колонку пятью объемами стерильной дистиллированной воды.
4. Промывайте колонку 0,3 М NaOH, пока элюат не будет иметь щелочную реакцию (обычно для этого необходимо пропустить 3—5 объемов щелочи).
5. Промойте колонку 10 объемами буфера для нанесения РНК.
6. Спиртовой осадок РНК соберите центрифугированием, удалите этанол ,:и высушите РНК в вакууме.
