Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 2. Выделение плазмидной ДНК из колоний стрептомицетов.
Метод основан на [29]
1. Перенесите колонию с чашки в пробирку для микроцентрифуги, стараясь не захватывать частиц агара.
2. Добавьте 30 мкл буфера ТЕ1', содержащего 2 мг/мл лизоцима. Суспендируйте колонию с помощью микропипетки. Инкубируйте при 30 °С в течение 15 мин.
3. Добавьте 15 мкл раствора, содержащего 0,3 М NaOH и 2% SDS. Немедленно перемешайте на встряхивателе.
4. Инкубируйте при 70 °С в течение 15 мин, затем охладите до комнатной температуры.
5. Добавьте 30 мкл смеси фенол—хлороформ2). Гомогенизируйте смесь на встряхивателе в течение 10 сек, затем открутите на микроцентрифуге 2 мин, для того чтобы фазы разделились.
6. На этой стадии водную фазу можно нанести на гель. Если же планируется провести рестрикционный анализ ДНК, перенесите водную фазу в чистую пробирку. Добавьте 4 мкл 3 М ацетата натрия и 45 мкл изопропанола. Перемешайте, несколько раз перевернув пробирку, и оставьте при комнатной температуре на 5 мин. Центрифугируйте в течение 2 мин, удалите надосадочную жидкость и промойте осадок несколько раз 40%-ным изопропанолом. Растворите осадок в 10 мкл дистиллированной воды; проба готова для рестрикционного анализа.
О ТЕ: 10 мМ трис; 1 мМ ЭДТА; pH 8,0.
2) 5 г фенола; 5 г хлороформа; 5 мг гидроксихинолииа.
264
Глава 2
Пример', банк генов содержит 8550 устойчивых к антибио-тику колоний. Проанализировано 40 клонов: 28 из них (т. е. 70%) содержат вставки, средняя длина которых 6,2 т.п.н.
5985 колоний из 8550 (это составляет 70%), вероятно, содержат вставки. Согласно данным, приведенным в табл. 1, для того, чтобы получить представительный геномный банк с вероятностью 95%, необходимо иметь 4837 колоний, а с вероятностью 99,99% — 14 850. Таким образом, вероятность того, что в нашем случае клонирован целый геном, больше 95%, но меньше 99,99%.
3. Культивирование штаммов
Высейте клетки Streptomyces на твердую среду (TSB или YEME), содержащую 1,5% агара (см. разд. 5). Инкубируйте чашку при 30 °С в течение нескольких дней, пока не произойдет споруляция. Выберите одиночную колонию, которая находится на достаточном удалении от своих соседей. С помощью стерильной микробиологической петли, смоченной в стерильной дистиллированной воде (влага способствует налипанию спор на петлю), захватите споры с поверхности колонии и затем суспендируйте их в 200 мкл стерильной воды.
Храните споры при —20 °С либо на косяке, либо в виде суспензии в 20%-ном водном растворе глицерина. Споры большинства штаммов в этих условиях остаются стабильными на протяжении нескольких лет.
Внесите споры с косяка в жидую среду YEME или TSB, налитую в конические колбы. Для этого суспендируйте поверхностный слой агарового косяка в нескольких миллилитрах стерильной дистиллированной воды с помощью стерильной пипетки или шприца с длинной иглой. Удалите остатки мицелия из суспензии, профильтровав ее через тампон из несорбирующей хлопковой ваты (рис. 5). В случае использования глицериновой суспензии споры осадите в настольной центрифуге (3000 g, 10 мин), после чего ресуспендируйте в стерильной воде (глицерин может ингибировать прорастание спор, поэтому его лучше удалить). Споры некоторых штаммов прорастают более активно, если их подвергнуть «тепловому шоку». С этой целью колбу с засеянной средой, перед тем как поместить на качалку на 30°С, инкубируют в течение 10 мин при 45—50°С.
Конические колбы энергично качают (300 об/мин в шейке-ре) для обеспечения хорошей аэрации. Большинство штаммов хорошо растет при 30 °С, однако есть и такие, например S. cla-vuligerus, которые очень плохо растут при 30 °С и хорошо — при 26 °С. Для выращивания 200 мл культуры из спор обычно требуется два дня.
Клонирование генов в стрептомицетах
265
Рис. 5. Приспособление для удаления остатков мицелия из суспензий спор и протопластов. В дне пробирки диаметром 1,25 см проделано отверстие с помощью стальной иглы, нагретой до красного каления. Это отверстие закрыто тампоном из несорбирующей ваты; нижняя часть пробирки вставлена в другую пробирку диаметром 2,5 см и удерживается в таком положении ватной пробкой. Суспензию спор (или протопластов) наливают во внутреннюю пробирку и фильтруют через слой ваты, собирая профильтрованную суспензию в наружную пробирку.
В некоторых лабораториях серьезную проблему представляет загрязнение грибами. Добавление циклогексимида (10 мкг/мл) к жидким и твердым средам ингибирует рост грибов, не влияя на развитие стрептомицетов. Среде TSB в целом следует отдать предпочтение, потому что ее проще готовить. Центрифугировать препараты в TSB легче — она не столь вязкая, как YEME, которая содержит большое количество сахарозы. Тем не менее некоторые штаммы не очень хорошо растут в TSB, и для них лучше использовать среду YEME.
4. Практическое руководство по клонированию ДНК
4.1. Краткий обзор процедуры клонирования ДНК в стрептомицетах
На рис. 6 показаны этапы получения банка клонов геномной ДНК стрептомицетов.
