Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 116

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 110 111 112 113 114 115 < 116 > 117 118 119 120 121 122 .. 253 >> Следующая

2.2.3. Фаговые векторы
Для молекулярного клонирования в стрептомицетах был разработан вектор на основе обладающего широкой хозяйской специфичностью актинофага ФС31 [21, 22]. Взаимоотношения этого фага с хозяином напоминают взаимоотношения фага К с клетками Е. coli. Фаг 0С31 имеет линейный геном с липкими концами; его размер — 41 т.п.н. Он может лизогенизировать клетки; состояние профага контролируется репрессором (продуктом гена С). Лизогенизация происходит путем рекомбинации специфических alt-сайтов фага с соответствующими областями хромосомы. В этом случае геном 0С31 присутствует в хозяйском геноме в виде единственной копии.
Были сконструированы варианты ФС31, маркированные генами устойчивости к тиострептону или виомицину, а также гибриды его с плазмидой pBR322. Эти последние конструкции размножают в клетках Е. coli и полученный плазмидный материал используют для выделения фаговой ДНК. Как и в случае фага Я, существуют ограничения на упаковку ДНК в головку фага 0С31. Известные на сегодняшний день фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК, не превышающие по размеру 7 т.п.н. Не вызывает сомнения, что в будущем появятся такие фаговые векторы, которые способны акцептировать более длинные вставки.
Чейтер разработал на основе ФСЗ\ систему «мутационного клонирования» [23]. Используя производный от <?С31 фаг, имеющий делецию в области att-сайта, можно создать банк генов любого неохарактеризованного представителя рода Strep-tomyces. Банк скринируют на «ухудшенный» фенотип (например, неспособность продуцировать антибиотик), который возникает как следствие внедрения фага в соответствующий ген: лизогенизация происходит за счет использования фагом клонированной ДНК в качестве замены отсутствующего у него att-сайта. Ухудшенный фенотип (блок-мутант) появляется только
262
Глава 2
в том случае, если клонированный фрагмент содержит неполную транскрипционную единицу, соответствующую искомому гену. Этот метод призван ускорить генетический анализ неоха-рактеризованных штаммов.
2.3. Статистический анализ
Для того чтобы ответить на вопрос, какое количество клонов со вставками данного размера является достаточным для представления полного генома стрептомицета-донора или какое количество ДНК, необходимо для выделения из банка определенного гена, придется обратиться к биномиальной теореме математической статистики. Геном стрептомицетов имеет размер 104 т.п.н. В табл. 1 приведены данные о количестве клонов указанного размера, которое с высокой вероятностью обеспечивает представление полного генома в банке генов стрептомицетов. Используя эту информацию, можно решить две задачи.
Определение количества вектора, необходимого для создания геномного банка. Эффективность трансформации первичным генным банком, как правило, в 100 раз ниже, чем эффективность трансформации интактным вектором. Обработка ДНК вектора фосфатазой (4.2.1) позволяет поднять долю рекомбинантных клонов лишь до 50%. Нетрудно подсчитать, сколько необходимо взять ДНК для конструирования банка.
Пример-, протопласты стрептомицетов трансформируются с эффективностью 5-105/мкг. Каково число колоний, составляющих геномный банк, если средний размер вставок — 7,5 т.п.н.?
Банк, представляющий 99,9% генома, должен насчитывать 13 810 рекомбинантных колоний (см. табл. 1). Если доля трансформантов, содержащих рекомбинантные молекулы, составляет 50%, необходимо иметь 27 620 (т. е. 2-13 810) трансформантов. Принимая, что трансформирующая способность генного банка
Таблица 1. Количество клонов со вставками данного размера, которое с заданной вероятностью обеспечивает получение полного банка генов Streptomyces
Средний размер Вероятность получения полного банка генов <%)
клонированных 80 90 95 99,99
фрагментов
(т. п. и.)
5 3218 4604 5998 18414
7,5 2414 3453 4491 13810
10 1609 2302 2994 9206
15 1072 1534 1998 6136
35 460 657 854 2627
Клонирование генов в стрептомицетах
263
составляет 5-103/мкг (т. е. 1/100 от 5-Ю5), получим искомое количество вектора:
(2,75-104)/(5• 103) =5,5 мкг.
Аналогичный расчет показывает, что для представления 95% генома понадобится 1,6 мкг векторной ДНК.
По возможности эксперимент всегда следует проводить с максимальным количеством ДНК, не опасаясь получить слишком много клонов, — это лучше, чем, используя минимальное количество ДНК, получить неполноценный банк из-за случайно неудавшейся трансформации.
Выяснение представительности банка генов. Отберите 30— 40 колоний из предполагаемого «банка» и пересейте их на свежие чашки, содержащие антибиотик, необходимый для селекции плазмид. Из каждого клона приготовьте лизат по быстрой методике (табл. 2) и обработайте его соответствующей рестрик-тазой, чтобы определить длину вставочного фрагмента ДНК. На основании полученных результатов подсчитайте частоту встречаемости колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, и средний размер вставок, с тем чтобы определить, достаточное ли количество вставочных последовательностей клонировано в данной выборке. Хотя 40 колоний, по всей видимости, слишком малая выборка для того, чтобы делать статистически обоснованные заключения, этот метод позволяет адекватно оценить потенциальные возможности предполагаемого банка.
Предыдущая << 1 .. 110 111 112 113 114 115 < 116 > 117 118 119 120 121 122 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed