Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Клонирование генов в стрептомицетах
259
2.2.2. Низкокопийные векторы
Еще не так давно низкокопийные векторы имели один существенный недостаток: сложность получения достаточно больших количеств ДНК. В настоящее время методология выделения плазмид разработана настолько хорошо, что такой проблемы практически не существует. Если стрептомицет-хозяин не обладает рестрикционной активностью {разд. 2.1.3), можно сконструировать гибрид на основе низкокопийного вектора Streptomyces и высококолийной плазмиды Е. coli, что позволит выделять ДНК вектора в больших количествах из Е. coli. Гибридная конструкция должна быть такова, чтобы при ее обработке соответствующей рестрикционной эндонуклеазой можно было изолировать фрагмент ДНК, включающий только вектор Streptomyces. Такой фрагмент легко можно будет отделять от последовательностей ДНК Е. coli и прямо использовать в реакциях лигирования.
SLP1.2. Плазмида SLP1.2 (14,5 т.п.н.) использовалась в ранних экспериментах по молекулярному клонированию в стрептомицетах [16]. Впервые она была обнаружена в экспрессирующих летальный зигозис вариантах S. lividans после межвидового скрещивания с S. coelicolor. Позднее было показано, что эта плазмида произошла от хромосомы S. coelicolor, где она присутствует в интегрированной форме [17]. В автономной форме в клетках S. lividans плазмида SLP1.2 представлена 4—
5 копиями.
Существуют производные SLP1.2, содержащие одиночные селективные маркеры или комбинации генов лекарственной устойчивости [18]. Среди них наиболее универсальной можно назвать плазмиду pIJ161 (15,7 т.п.н.), которая несет гены устойчивости к тиострептону (tsr) и неомицину (aph) (рис. 3). Внутри гена aph находятся уникальные сайты узнавания рест-
В атн I
Е с о R I
PIJ702
(5 , 6 Т. и,и.)
Рис. 2. Рестрикционная карта плазмиды pIJ702. Клонирование в уникальных сайтах Sphl, Bglll и Sstl приводит к инактивации гена met.
(I 5 ,7т.п.н.)
Рис. 3. Рестрикционная карта плазмиды pIJ61. Уникальные сайты PstI и BamHl локализуются внутри гена, определяющего устойчивость к неомицину
17*
260
Глава 2
Eco RI
Pst I piJ 922
(2 4Т.П.Н.")
Рис. 4. Рестрикционная карта плазмиды pIJ922 Г20]. Все указанные на рисунке рестрикционные сайты пригодны для клонирования.
риктаз ВатШ и Pstl. Клонирование в каждом из этих сайтов приводит к экспрессии чувствительного к неомицину фенотипа, что обеспечивает возможность удобного скрининга колоний с использованием феномена «инсерционной инактивации». Наличие сайта ВатШ позволяет клонировать случайные фрагменты, образующиеся в результате обработки ДНК рестриктазами Sau3A или Mbol, как это было описано для pIJ702 (разд. 2.2.1).
Национальная исследовательская корпорация Великобритании владеет патентом на репликон SLP1.2. Однако это не должно обескураживать ученых, планирующих в своей научной работе использование данного вектора. Сложности с патентованными векторами возникают лишь тогда, когда речь идет о применении их в коммерческих целях; для научных целей все патентованные векторы предоставляются безвозмездно.
Сообщалось, что хозяйская специфичность репликонов на основе SLP1.2 ограничена [18]. Ограничения здесь могут бцть вызваны несовместимостью вектора с собственными плазмидами потенциального хозяина или его рестрикционной активностью (разд. 2.1.3). Не исключено, что хозяйская специфичность базового репликона шире, чем считалось до сих пор.
SCP2. Несмотря на то что плазмида SCP2 — первая плазмид a Streptomyces, которая стала объектом систематического изучения в плане ее физических свойств [19], широкого распространения в качестве вектора для клонирования она не имела — во-первых, из-за наличия только метиленомициновой устойчивости [1] и, во-вторых (до недавнего времени), из-за невыгодной конкуренции с SLP1.2. Плазмида SCP2 (30 т.п.н.) — природный половой фактор 5. coelicolor\ она присутствует в количестве 1—3 копий на клетку, трансмиссибельна и экспрессирует летальный зигозис.
рП922 (рис. 4; [20]). Это наиболее удачный вариант плазмиды SCY2. pIJ922 имеет размер 24,5 т.п.н., маркирована геном
Клонирование генов в стрептомицетах
261
устойчивости к тиострептону и несет ряд уникальных сайтов рестрикции, пригодных для клонирования. Успешное клонирование в этом векторе генов метаболического пути актинородина [7], без сомнения, заставит по-новому оценить его пригодность для экспериментов такого рода.
Подобно SLP1.2, плазмиде SCP2 первоначально приписывали узкую хозяйскую специфичность. Однако, если проводить селекцию по маркерам лекарственной устойчивости (как, например, в случае pIJ922), а не на основе летального зигозиса и использовать дефектных по системе рестрикции хозяев, вполне может оказаться, что хозяйская специфичность 5СР2-репли-конов, как и SLP1.2, гораздо шире, чем принято думать.
