Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2.2.1. Высококопийные векторы
Известно несколько высококопийных векторов (см. ниже). Предпочтительно использовать векторы на основе pIJlOl, поскольку все они хорошо изучены и обладают высокой эффективностью трансформации.
Высококопийные векторы выделить несложно; они с успехом использовались во многих недавних экспериментах по молекулярному клонированию. Число их копий в клетке может достигать столь высокого значения, что гиперэкспрессия некоторых
Клонирование генов в стрептомицетах
257
клонированных в них генов оказывается вредной для клетки. Малпартида и Хопвуд [7] клонировали в составе низкокопий-ного вектора два фрагмента ДНК, кодирующих фрагменты метаболического пути одного из антибиотиков. Эти фрагменты упорно «сопротивлялись» клонированию в составе высококопий-ного вектора. Не удалось также в дальнейшем переклонировать участки этих последовательностей из низкокопийного вектора в высококопийный. Можно предположить (хотя это и не доказано), что в данном случае гиперэкспрессия некоторых клонированных генов оказывается летальной для клетки. Этот аспект молекулярной биологии стрептомицетов следует иметь в виду при выборе стратегии клонирования.
pIJlOl. Плазмиды, являющиеся производными pIJlOl, часто используются для экспериментов типа «шотган» (т. е. для клонирования ДНК, фрагментированной случайным образом). pIJlOl—одна из представительниц семейства плазмид, выделенных из штамма S. lividans г 12]. Штамм содержит еще три плазмиды меньшего размера, которые, по данным рестрикционного анализа, представляют собой делеционные варианты родительской плазмиды (plj 101), возникшие in vivo, pi J101 относится к трансмиссибельным плазмидам и экспрессирует летальный зигозис (разд. 4.7.1). Анализ поведения делеционных мутантов in vivo и in vitro позволил осуществить предварительное картирование соответствующих генетических детерминант С12]. pIJlOl (9 т.п.н.) обладает самой широкой хозяйской специфичностью из всех известных на сегодняшний день плазмид стрептомицетов. Например, в оригинальной публикации Г12] сообщалось, что эта плазмида «прижилась» в 13 из 18 опробованных штаммов. С тех пор данный репликон неоднократно использовался в экспериментах со многими другими штаммами.
У S. lividans число копий плазмиды варьирует от 40 до 300 на клетку. Делеционные мутанты отличаются еще более высокой копийностью. Количество копий в определенной степени зависит от штамма: например, клетки S. rimosus дают более высокий выход плазмидной ДНК, чем 5. lividans, что может указывать на более высокую множественность плазмиды в 5. rimosus.
На основе pIJlOl in vitro были сконструированы уменьшенные варианты, маркированные рядом детерминант лекарственной устойчивости [12]. В первую очередь из них следует упомянуть ген устойчивости к тиострептону (клонированному из
5. azureus), так как большинство стрептомицетов чувствительны к этому агенту. Тиострептон-устойчивая плазмида размером
4,1 т.п.н. — производная pIJlOl—обозначена pIJ350 [12].
Более удачный вектор (piJ702) был получен путем субклонирования в piJ350 фрагмента ДНК, содержащего ген тирози-назы S. antibioticus г 13]. Колонии 5. lividans, экспрессирующие
17—196
258
Глава 2
активную тирозиназу (Ме1+), имеют черную окраску на среде, содержащей триптон и ионы меди, что позволяет проводить прямой визуальный скрининг. pIJ702 имеет ряд уникальных рестрикционных сайтов внутри гена mel (рис. 2). При клонировании по данным рестриктазам внедрение чужеродных последовательностей ДНК в ген mel приводит к его инактивации, вследствие чего колонии трансформантов оказываются бесцветными. Таким образом, клонирование ДНК по этой схеме можно легко контролировать с помощью теста на «инсерционную инактивацию». Уникальный сайт BglII внутри гена mel плазмиды piJ702 особенно полезен в экспериментах типа «шотган». Липкие концы вектора, обработанного Bgl\I, совместимы с липкими концами, образующимися при действии многих других рестриктаз (BamHI, Xholl, Bell, SauSA, Mbol). Sau3A и Mbol узнают тетрануклеотидные последовательности GATC, которые часто встречаются в ДНК стрептомицетов; частичный гидролиз донорной ДНК Sau3A или Mbol дает набор случайных фрагментов, которые можно лигировать с плазмидой piJ702, обработанной рестриктазой В gill.
pFJ103. Плазмида pFJ 103 разработана группой Лилли [14]. Изначально она была выделена как 20 т.п.н.-плазмида из
5. granuloruber. После введения в ее состав гена устойчивости к тиострептону in vitro был получен уменьшенный вариант реп-ликона (pFG105, 4,7 т.п.н.). Точных данных о копийности этой плазмиды не сообщалось, хотя легкость выделения плазмидной ДНК предполагает наличие большого числа копий. В качестве хозяев этой плазмиды могут выступать S. ambofaciens, S. fra-diae, S. aureofaciens. Отмеченная эффективность трансформации (4,6- 103/мкг) недостаточно высока для того, чтобы считать эту плазмиду действительно удачным вектором для клонирования (см. разд. 2.3).
рЬСб. Плазмида pUC6 — криптическая плазмида размером
9,2 т.п.н. — выделена Апджоном из клеток 5. espinosus [15]. Она представлена в клетке 30—40 копиями. В результате мутагенеза in vitro получен делеционный мутант pUC6 (7,2 т.п.н.), имеющий повышенную копийность (число копий — 500—600). Это самая высокая копийность, известная на сегодня для плазмид стрептомицетов; на долю плазмиды приходится более 40% тотальной клеточной ДНК. Скрининг pUC 1061 затруднен ввиду отсутствия в этой плазмиде детерминант лекарственной устойчивости; экспрессия летального зигозиса также не характерна для pUC 1061. Для того чтобы использовать эту плазмиду в качестве вектора, ее надо усовершенствовать путем введения селективных маркеров. Эта задача представляется относительно несложной.
