Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 113

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 253 >> Следующая

Другой, менее строгий тест можно провести, используя бифункциональный (Streptomyces/Е. coli) вектор. Для этого плазмидную ДНК выделяют из Е. coli; хозяйский штамм Streptomyces, у которого полностью отсутствует рестрикционная активность, будет трансформироваться этой ДНК с такой же эффективностью, как и плазмидной ДНК, выделенной из самого хозяйского штамма. Таким путем было, например, показано, что S. ambofaciens лишен рестрикционной активности [14].
Мутагенез
Получение протопластов
Трансформация немсдисрииированной днк
Высев на селективную среду' (с тиострептоном)
Отбор отдельных немногочисленных колоний
Субкультивирование в неселентивных ¦условиях.
Выделение спонтанно возникающих клонов, ¦чувствительным тиострептону
Получение протопластов
Трансформация немодифицированной ДНК
Высев на селективную среду (с тиострептоном)
Рис. 1. Стратегия селекции штаммов Streptomyces, дефектных по системе рестрикции.
Клонирование генов в стрептомицетах
255-
Если же в хозяйском штамме предполагается наличие рестрикционной активности, у исследователя остаются три возможности.
1. Выбрать другой штамм — это радикальное решение проблемы.
2. Попытаться получить мутанты хозяйского штамма с пониженной активностью системы рестрикции.
3. Подвергнуть протопласты тепловому шоку, чтобы ингибировать их рестрикционную активность.
Второй путь (рис. 1) был успешно опробован на промышленном штамме S. rimosus. Полученные мутанты фенотипически оказались дефектными по рестрикции (хотя знзимологические аспекты нарушения специально не исследовались) [10]. Изначально S. rimosus плохо трансформировался ДНК pPZ33 (бифункциональный вектор Е. coli/Streptomyces на основе-pIJlOl — см. разд. 2.2.1), выделенной из Е. coli (2-102/мкг), и хорошо — этой же плазмидной ДНК, выделенной из S. rimosus (7-105/мкг). Мутантный штамм трансформировался плазмидной ДНК из Е. coli с эффективностью 6-105/мкг, что указывает на отсутствие рестрикционного барьера между Е. coli и S. rimosus.
Третий путь предусматривает 10—15-минутную инкубацию протопластов при 40—50 °С для того, чтобы инактивировать ферменты рестрикции. Протопласты в этих условиях остаются жизнеспособными и сохраняют способность к трансформации. Точное значение температуры и продолжительность обработки подбираются эмпирически для каждого штамма. К сожалению,, не все штаммы обладают термолабильной системой рестрикции.
2.1.4. ДНКазная активность хозяйского штамма
Некоторые стрептомицеты продуцируют активные ферменты,, вызывающие деградацию ДНК [11]. Эти ферменты могут выделяться в среду культивирования интактными протопластами или накапливаться там за счет лизиса части протопластов. Таким образом, при добавлении плазмидной ДНК к суспензии протопластов эта ДНК может частично разрушаться и утрачивать трансформирующую активность.
ДНКазную активность протопластов можно оценить следующим образом. Известное количество плазмидной ДНК добавляют к суспензии протопластов, инкубируют короткое время,. после чего протопласты осаждают центрифугированием в микроцентрифуге. Надосадочную жидкость наносят на агарозный гель и проводят электрофорез для качественной оценки ДНК-Если наблюдается деградация ДНК, стоит проверить, не инактивируется ли ДНКазная активность тепловым шоком (см. разд. 2.1.3), хотя это маловероятно. Добавление к суспензии'
.256
Глава 2
протопластов гетерологичной ДНК (например, ДНК тимуса теленка) до введения плазмидной ДНК обеспечивает частичную защиту от ДНКаз. Добавление тимусной ДНК (по крайней мере в количестве до 100 мкг к 100 мкл протопластов) не оказывает ощутимого влияния на трансформацию плазмидной
днк.
2.1.5. Активность системы рекомбинации хозяина
Стрептомицетам свойственна высокая рекомбинационная активность. Между тем использование дефектного по рекомбинации стрептомицета-хозяина могло бы свести к минимуму вероятность делеции или -перестройки клонированных фрагментов ДНК. Хотя известен ряд мутантов Streptomyces, которые чувствительны к УФ облучению, нет сколько-нибудь достоверных данных о селекции дефектных по рекомбинации штаммов. Подобный штамм можно смело назвать мечтой всех исследователей, работающих в данной области. И если таковой появится, ему, без сомнения, следует отдать предпочтение.
2.2. Вектор
В научной и патентной литературе описано большое число плазмид стрептомицетов. Поэтому выбор векторов нельзя назвать ограниченным, просто некоторые из них разработаны и охарактеризованы лучше, а другие — хуже.
Свойства векторов сильно различаются и удовлетворяют самым разным требованиям. Это могут быть высоко- и низко-копийные плазмиды или представленные одиночными копиями лизогенизирующие фаги. Плазмидные векторы могут быть трансмиссибельными или нетрансмиссибельными; они могут быть криптическими и идентифицироваться благодаря феномену «летального зигозиса» (когда колония, содержащая плазмиду при репликации на газон растущих бесплазмидных клеток, образует прозрачную зону — см. раздел. 4.7.1) либо могут нести детерминанты лекарственной устойчивости.
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed