Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Часто оказывается более целесообразным сначала получить рекомбинантную плазмиду в Е. coli, а затем перевести ее в В. subtilis. Подобно многим стафилококковым и бациллярным генам лекарственной устойчивости, стафилококковый ген егтС плазмиды рЕ194 функционирует в Е. coli [73]. Однако Е. coli сама по себе устойчива к эритромицину, и чтобы отличить трансформантов от клеток, не несущих ген егтС, необходимо значительно увеличить концентрацию эритромицина в среде или использовать штаммы с повышенной чувствительностью к этому антибиотику [73]. Инактивация гена егтС в высокочувствительном штамме DB11 распознается по чувствительности клеток к эритромицину при его концентрации в L-arape 5 мкг/мл. Рекомбинантные плазмиды, имеющие вставку внутри гена егтС, таким образом, легко идентифицируются в Е. coli. Существуют химерные (несущие ген егтС) плазмиды, которые способны реплицироваться как в Е. coli, так и в Bacillus — например, рКН80, сконструированная из pBD9 и pBR322 [63]. Перед введением в клетки В. subtilis та часть этой плазмиды, которая обусловливает сродство к Е. coli, может быть легко удалена.
В типичных экспериментах по изучению продукции чужеродного белка под контролем гена егтС [64] клетки выращивали в VY-среде до ОП6оо = 0,2, затем добавляли эритромицин до концентрации 0,05 мкг/мл (субингибирующая концентрация) и инкубировали культуру еще 2 ч в условиях интенсивной аэра-
Методы клонирования в бациллах
249
ции. Затем клетки разрушали ультразвуком и полученные экстракты анализировали на присутствие чужеродного белка с помощью вестерн-блот-анализа [66] или другими методами.
Хлорамфеникол-устойчивость В. pumilus, по всей видимости, также контролируется на трансляционном уровне; возможность ¦использования соответствующего промотора для экспрессии клонированных генов была детально изучена Ловеттом с соавт. [49, 50].
Благодарности
Я весьма признателен С. Д. Эрлиху, взявшему на себя труд написать вводную часть этой главы.
Литература
1. Keggins К. М., Lovett P. S., Duvall Е. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1423 (1978).
2. Gryczan T. J., Dubnau D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1428 (1978).
3. Ehrlich S. D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1433 (1978).
4. Palva I., Lehtovaara P., Kaariainen L., Sibakov M„ Cantell K., Schein С. H., Kashiwagi K-, Weissmann C. Gene, 22, 229 (1983).
5. Mosbach K-, Birnbaum S., Hardy K., Davies J., Bulow L. Nature, 302, 543 (1983).
6. Losick R. In: Molecular Biology of the Bacilli, Dubnau D. (ed.), Academic
Press, New York, p. 179 (1982).
7. Ehrlich S. D., Niaudet B., Michel B. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 96,
19 (1982).
8. Hemphill H. E., Whiteley H. R. Bacteriol. Rev., 39, 257 (1975).
9. Okamoto K., Mudd J. A., Marmur J. J. Mol. Biol., 34, 429 (1968).
10. Dubnau D„ Cirigliano C. J. Bacteriol., 117, 488 (1974).
11. Tanaka T. J. Bacteriol., 139, 775 (1979).
12. Ehrlich S. D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1680 (1977).
13. Tanaka T. Mol. Gen. Genet., 175, 235 (1979).
14. Trautner T. A., Pawlek B., Bron S., Anagnostopoulos C. Mol. Gen. Genet., 131, 181 (1974).
15. Gordon R. E., Haynes W. C„ Pang C. H.-N. The Genus Bacillus, U.S. Dept of Agriculture, Washington, DC, 1973.
16. Wilson G. A., Young F. E., J. Bacteriol., Ill, 705 (1972).
17. Yasbin R. E., Fields P. I., Anderson B. J. Gene, 12, 155 (1980).
18. Reeve J. In: Methods in Enzymology, Wu R. (ed.), Academic Press Inc.,
London and New York, Vol. 68, p. 493 (1979).
19. Polak J., Novick R. P. Plasmid, 7, 152 (1982).
20. Horinouchi S., Weisblum B. J. Bacteriol., 150, 804 (1982).
21. Horinouchi S., Weisblum B. J. Bacteriol., 150, 815 (1982).
22. Goze A., Ehrlich S. D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7333 (1980).
23. Kreft J., Hughes C. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 96, 1 (1982).
24. Uhlen М., Flock J. /., Philipson L. Plasmid, 5, 161 (1981).
25. Michel B„ Niaudet B., Ehrlich S. D.t EMBO J., 1, 1565 (1982).
26. Copeland I. C., Marmur M. /. Bacteriol. Rev., 32, 302 (1968).
27. Kawamura F., Saito H„ Ikeda Y. Gene, 5, 89 (1979).
28. Yamasaki H., Ohmura K-, Nakayama A., Takeichi Y., Otazaki K-, Yama-
saki М., Tamura G., Yamane K. J. Bacteriol., 156, 327 (1983).
29. lijima Т., Kawamura J., Saito H., Ikeda Y. Gene, 5, 87 (1979).
250
Глава 1
30. Flock J. I. Mol. Gen. Genet., 189, 304 (1983).
31. Marrero R., Lovett P. S. J. Bacteriol., 143, 879 (1980).
32. Yoneda Y„ Graham S., Young F. E. Gene, 7, 51 (1979).
33. Heilmann H., Reeve J. N. Gene, 17, 91 (1982).
34. Bernhard K., Schrempf H., Goebel W., J. Bacteriol., 133, 879 (1978).
35. Bingham A. H A., Bruton C. J., Atkinson T. J. Gen. Microbiol., 114, 401 (1979).
36. Lovett P. S., Duvall E. J., Keggins К. M. J. Bacteriol., 127, 817 (1979).
37. Lovett P. S. Duvall E. J., Bramucci M. G., Taylor R. Antimicrob. Agents Chemother., 12, 435 (1977).