Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Мини-клетки готовят и хранят как описано в табл. 8. Из 400 мл исходной культуры обычно можно получить 2 мл суспензии мини-клеток с ОПбоо = ОД что соответствует приблизительно 5-109 мини-клеток/мл. Удовлетворительное включение метки получается в том случае, если количество жизнеспособных клеток не превышает 5-103 на 109 мини-клеток. Ниже приведена экспериментальная процедура мечения мини-клеток.
1. Дайте мини-клеткам оттаять, поместив их на водяную баню при 48 °С.
2. Центрифугируйте суспензию мини-клеток в течение 90 с в микроцентрифуге на максимальной скорости.
3. Ресуспендируйте мини-клетки в 0,2 мл смеси, включающей 1 объем 0,4%-ной (по весу) среды для определения метионина (Difco), 3 объема минимальной среды, содержащей 100 мкг/мл тимина и 0,5% (по весу) глюкозы.
4. Добавьте 0,1 мл раствора D-циклосерина (500 мкг/мл) и инкубируйте при 37 °С 10 мин.
5. Внесите 100 мкКи [35S] метионина (70 Ки/ммоль) и инкубируйте при 37 °С 30 мин на качалке в пробирке на 5 мл.
6. Добавьте 0,1 мл раствора метионина (0,2 мг/мл) и инкубируйте при 37 °С 10 мин.
7. Центрифугируйте 90 с в микроцентрифуге на максимальной скорости. Удалите радиоактивную надосадочную жидкость.
8. Ресуспендируйте осадок мини-клеток в 1 мл воды. Цент-
Методы клонирования в бациллах
247
Таблица 8. Приготовление мини-клеток
1. Вырастите культуру штамма CU403 при 30 °С в течение ночи в 100 мл L- или VY-среды в колбе на 1 л.
2. Внесите некоторое количество этой культуры в 400 мл минимальной среды4, содержащей 0,5% (но весу) глюкозы, 100 мкг/мл метионина и 100 мкг/мл тимина, до достижения ОПбоо = 0,1—0,2. Растите в двухлитровой колбе при энергичном перемешивании до ОПбоа=1,0. Поместите колбу на лед, чтобы охладить клетки.
3. Центрифугируйте при 0 °С в роторе Sorvall GSA (или эквивалентном) в течение 10 мин при 10 000 об/мин, удалите надосадочную жидкость и энергично ресуспендируйте осадок в 5 мл холодной минимальной среды без глюкозы, метионина и тимина.
4. Аккуратно наслоите суспензию на два 25 мл сахарозных градиента2* (5—35%) в пробирках Согех. Центрифугируйте при 0°С в бакет-роторе Sorvall НВ-4 (или эквивалентном) при 5000 об/мин в течение 20 мин.
5. Отберите фракцию мини-клеток, которая сформируется в виде полосы в центральной части градиента, с помощью пастеровской пипетки с изогнутым V-образным кончиком.
6. Осадите собранные мини-клетки центрифугированием при 0 °С в роторе Sorvall SS34 (или эквивалентном) в течение 20 мин при 5000 об/мин.
7. Ресуспендируйте мини-клетки в двух 5 мл аликвотах холодной минимальной среды и повторите этапы 4—6.
8. Дважды промойте мини-клетки, ресуспендируя их в 5 мл холодной минимальной среды и центрифугируя затем при 0 “С в роторе Sorvall SS34 (или эквивалентном) в течение 10 мин при 12 500 об/мин.
9. Если мини-клетки не будут сразу использоваться для включения метки, их можно сохранить, ресуспендировав в 3 мл холодной минимальной среды, содержащей 10%-ный (по объему) глицерин, заморозив в спиртовой бане с сухим льдом и поместив в морозильную камеру на —70 °С.
>) Минимальная среда Спицайзена (см. раздел 2.5), с добавлением 0,5 мМ СаС12; 0,1 мМ MnS04 , 0,005 мМ FeCl3. Стерилизовать автоклавированием.
2) Сахарозные градиенты удобно готовить по методу Стоуна [68]: в центрифужной пробирке Согех наслоите 12,5 мл 5%-ного (по весу) раствора сахарозы в минимальной среде на 12,5 мл 35%-ного раствора. Наклоните пробирку и оставьте ее под углом 30°
на 18 ч при 4 °С.
рифугируйте 90 с в микроцентрифуге на максимальной скорости и удалите надосадочную жидкость.
9. Ресуспендируйте мини-клетки в 50 мкл водного раствора лизоцима (0,5 мг/мл) и инкубируйте 2 мин при 37 °С.
10. Добавьте 100 мкл буфера для нанесения на гель (0,0625 М трис-НС1, pH 6,8; 2% SDS; 5% 2-меркаптоэтанола; 10% глицерина; 0,002% бромфенолового синего).
11. Прогрейте пробу при 100 °С в течение 3 мин и нанесите на 12% ПААГ (процентное содержание акриламида в геле можно изменить в соответствии со свойствами конкретных изучаемых белков). Гель приготавливают, например, по методике, данной в [69]. В лунку наносите приблизительно 50 000 имп/мин.
12. По окончании электрофореза [69] окрашивайте гель в течение 4—8 ч в водном растворе, содержащем 40% (по объему) уксусной кислоты, 20% (по объему) метанола, 0,1% (по
248
Глаыа 1
весу) кумасси голубого. Промойте гель в водном растворе 10%-ной (по объему) уксусной кислоты с 30%-ным метанолом и поместите в сцинтиллятор типа Enhance (New England Nuclear) на 1 ч. Промывайте гель в течение 1 ч, два раза меняя воду, высушите в вакууме и экспонируйте с ним рентгеновскую пленку (Kodak X-Omat R) при —70 °С [70].
5.2. Использование гена устойчивости к эритромицину (еггпС) для экспрессии клонированных генов
Ген егтС плазмиды рЕ194 [71] кодирует РНК-метилазу, которая катализирует специфическое №,Й6-диметилирование рибосомной РНК, что определяет устойчивость клетки к действию эритромицина [72]. Синтез этой редуктазы индуцируется субингибирующими концентрациями эритромицина [72]. Индукция осуществляется на уровне трансляции мРНК, поэтому в данном случае речь не идет об идеальном транскрипцион-но контролируемом промоторе, который был бы особенно полезен для экспрессии клонированных генов. Тем не менее этот ген регулируется, что позволяет получать довольно высокий выход чужеродного белка в Bacillus (не менее 1 % от тотального клеточного белка) [64].
