Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Полиэтиленгликоль
К 40 г полиэтиленгликоля (PEG6000; Sigma) добавьте 50 мл 2XSMM, доведите объем раствора водой до 100 мл и автоклавируйте при 0,7 атм
Среда DMP для регенерации протопластов
DMP приготавливают, смешивая описанные ниже компоненты, которые предварительно стерилизуют по отдельности
а) Питательный агар
Агар (Difco) 10 г
Казаминокислоты (Difco) 5 г
Дрожжевой экстракт (Difco) 5 г
Воды до 350 мл; автоклавировать 15 мин при 0,7 атм
б) Фосфат калия
КН2Р04 1,5 г
КгНР04 3,5 г
К каждой навеске добавить воды до 50 мл, растворы смешать и автоклавировать 15 мин при 1 атм
в) Глюкоза 20 г Воды до 100 мл; автоклавировать 10 мин при 0,7 атм
г) MgCl2-6H20 20,3 г Воды до 100 мл; автоклавировать 15 мин при 1 атм
д) Сущинат натрия
Янтарная кислота (двунатриевая соль) 81 г
Поливинилпирролидон (PVP) 80 г
Воды до 500 мл; довести pH до 7,3, добавив NaOH Автоклавировать 10 мин при 1 атм
Автоклавированные компоненты смешивают в следующих количествах: Сукцинат натрия+ PVP 500 мл
Питательный агар 350 мл
Фосфат калия 100 мл
Глюкоза 25 мл
MgCl2 20 мл
Растворы рекомендуется смешивать вскоре после автоклавирования, пока они горячие. Когда среда охладится приблизительно до 50 °С, добавляют необходимые антибиотики
Методы клонирования в бациллах
245
1. Используйте пластиковую или чистую (не содержащую следов детергента) стеклянную посуду на всех этапах эксперимента.
2. Инокулируйте 50 мл VY- или L-среды в колбе на 500 мл несколькими колониями со свежей чашки (18 ч).
3. Растите в условиях интенсивной аэрации до С)Пбоо = 0,4.
4. Центрифугируйте культуру 10 мин при 5000 об/мин в роторе Sorvall GSA (или эквивалентном). Удалите надосадочную жидкость, а осадок ресуспендируйте в 5 мл среды SMMLBP (см. табл. 7).
5. Добавьте 260 мкл раствора, содержащего 20 мг/мл лизо-дима (раствор лизоцима в SMMLBP готовят незадолго до использования и стерилизуют фильтрованием).
6. Инкубируйте при 37 °С. Через определенные промежутки времени отбирайте аликвоты и исследуйте их. в фазово-контрастном микроскопе, чтобы определить количество протопластов. Когда в протопласты превратится не менее 99% клеток, добавьте 1—5 мкг ДНК в 10 мкл буфера ТЕ (или воды) и
1,5 мл 40%-ного (по весу) раствора полиэтиленгликоля. Осторожно перемешайте и оставьте на 2 мин при комнатной температуре.
7. Добавьте 5 мл среды SMMLBP и аккуратно перемешайте.
8. Центрифугируйте 10 мин при 3000 об/мин в роторе Sorvall SS34 (или эквивалентном).
9. Ресуспендируйте протопласты в 1 мл среды SMMLBP и инкубируйте при 37° в течение 90 мин, мягко покачивая.
10. Рассейте аликвоты по 0,1 мл на чашки со средой DMP для регенерации протопластов (табл. 7), содержащей соответствующий антибиотик. Канамицин гораздо менее эффективен при введении в среду DMP, поэтому его концентрацию необходимо довести до 1 мг/мл. Тетрациклин, хлорамфеникол и эритромицин добавляют в концентрации 5 мкг/мл.
5. Методы изучения экспрессии генов в клетках бацилл
Многие экспериментальные процедуры, применяемые для изучения экспрессии генов в клетках Е. coli, можно использовать для работы с бациллами либо без всяких изменений, либо с небольшими вариациями. Так, например, метод Брума-Гилберта [63], предназначенный для выявления антигенов, продуцируемых бактериями, можно модифицировать для бацилл, заменив инфекцию вирулентным бактериофагом на лизис клеток под действием лизоцима. По 5 мкл водного раствора лизоцима в концентрации 2 мг/мл капают на 5-миллиметровые бактериальные штрихи, выращенные на поверхности агара, и инкубируют чашки в течение 30 мин при 37°С [64].
246
Глава 1
Чамблисс с соавторами подробно описали метод приготовления экстрактов из В. subtilis для транскрипции и трансляции ДНК in vitro [65]. Для изучения экспрессии генов в бациллах также оказываются полезными мини-клетки [18]. Ряд методов основан на способности бацилл секретировать белковые продукты. Белки, высвобождающиеся из бактериальных клеток, которые растут на поверхности нитроцеллюлозного фильтра, помещенного на L-arap, легко идентифицируются с помощью стандартной процедуры Вестерн-блотинга [66] — достаточно лишь отмыть фильтр от бактерий.
5.1. Приготовление и мечение мини-клеток бацилл
В ряде исследований, касающихся белков, кодируемых бактериофагами и плазмидами, в качестве продуцента мини-клеток использовали штамм CU403 (табл. 1) [18]. Эти бактерии растут на минимальной среде с добавлением лишь глюкозы, тими-на и метионина. Они не лизируются при центрифугировании в градиентах концентрации сахарозы при 4°С и не образуют спор. Подобно большинству 8ро_-штаммов, CU403 с трудом дает компетентные клетки. Плазмиды обычно вводят в эти клетки путем трансформации протопластов.
