Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
1. Нарастите 1,5 мл культуры в VY- или L-бульоне в 5 или 10 мл пробирке до ОП6оо приблизительно равной 1. В идеале к этому моменту культура должна еще оставаться в логарифмической фазе роста.
2. Осадите клетки центрифугированием в микроцентрифуге в течение 1 мин.
3. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл раствора I, содержащего 2 мг/мл лизоцима. (Лизоцим следует добавлять в раствор I непосредственно перед использованием.) Оставьте пробирку на 15 мин во льду.
4. Добавьте 200 мкл раствора II. Перемешайте встряхиванием и оставьте во льду на 5 мин.
5. Добавьте 150 мкл раствора III. Встряхните и оставьте во льду на 1 ч.
6. Центрифугируйте при 4°С в течение 5 мин на максимальной скорости микроцентрифуги.
7. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и добавьте 1 мл этанола. Выдерживайте при —70 °С в спиртовой бане с сухим льдом в течение 10 мин.
8. Центрифугируйте при 4°С в течение 10 мин на максимальной скорости микроцентрифуги.
9. Аккуратно удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте осадок в 100 мкл раствора IV.
10. Добавьте 250 мкл этанола. Встряхните и центрифугируйте в микроцентрифуге при 4°С в течение 10 мин.
11. К осадку добавьте 400 мкл этанола. Центрифугируйте в микроцентрифуге при 4 °С в течение 2 мин.
12. Удалите надосадочную жидкость, высушите осадок в вакуумном эксикаторе и затем ресуспендируйте в 30 мкл буфера ТЕ. Храните при —20 °С.
4. Приготовление и хранение компетентных клеток
В клетки бацилл плазмиды можно вводить четырьмя способами: трансформацией компетентных клеток, трансформацией протопластов, трансдукцией с помощью бактериофага AR9 (см., например, 41), а также мобилизацией с использованием конъю-гативной плазмиды pAM^l [56], имеющей широкую хозяйскую специфичность.
При работе с В. subtilis применяют трансформацию компетентных клеток и протопластов. Для других видов бацилл методы получения компетентных клеток пока не разработаны,
\
\
________________Методы клонирования в бациллах_________ 24.11
поэтому здесь для трансформации обычно используются протопласты.
Важное отличие В. subtilis от Е. coli состоит в то|м, что' . мономерные ковалентно замкнутые кольцевые плазмиды не-трансформируют эти клетки с достаточной эффективностью. Трансформацию компетентных клеток бацилл можно осуществлять лишь с помощью мультимерных плазмид [57, 58]. Полная дупликация плазмиды в виде димера или тримера на самом; деле необязательна. Достаточно дуплицировать только часть молекулы [25]. В то же время протопласты относительно легко трансформируются мономерными плазмидами. На практике-мономерные молекулы при трансформации протопластов оказываются даже более эффективными, чем мультимеры. Поскольку для успешной трансформации компетентных клеток Bacillus необходимы мультимерные плазмиды, эффективность этой процедуры можно значительно повысить, если соответствующую плазмидную ДНК сначала расщепить эндонуклеазой,, имеющей на ней единичный сайт узнавания, а затем провеет реакцию лигирования и получить мультимерные формы этой плазмиды.
Компетентные клетки легче приготовить и хранить, чем протопласты. Кроме того, богатая среда, используемая для регенерации протопластов, не позволяет проводить прямую селекцию-по маркерам ауксотрофности, и для этой цели надо использовать метод реплик.
Степень компетентности культуры бацилл зависит от стадик роста. Для того чтобы стимулировать клетки к захвату ДНК„ их выращивают на богатой среде, а затем переносят на бедную» среду, где отсутствуют аминокислоты, необходимые ауксотроф-ным мутантам. Время, которое требуется клеткам для достижения состояния максимальной компетентности, варьирует в? зависимости от штамма [54]. Следует заметить, что только малая часть клеток в компетентной культуре (около 0,1%) действительно способна принять ДНК при насыщающих концентрациях последней.
Опубликовано несколько модификаций оригинальных процедур Анагностопулоса и Спицайзена [54] (см., например,.
[61]); ниже мы приводим метод, основанный на разработках Дубнау и Давидов-Абельсона [60].
4.1. Метод получения компетентных клеток
1. Внесите колонию реципиентного штамма в 10 мл среды-SP1 (табл. 6). Среда должна содержать аминокислоты (в концентрации 50 мкг/мл), соответствующие потребностям данного-ауксотрофного штамма, и тимин (в концентрации 100 мкг/мл,. если используемый штамм имеет фенотип Thy-). Глюкоза до-
16 -196
2 42
Глава 1
Таблица 6. Среда для получения компетентных клеток
Среда 4xSP (для SP1 и SP2)‘> (NH4)2S04
К2НРО4
КН2Р04
Трехзамещенный цитрат, натрия-2^0
MgS04-7H20
Казаминокислоты (Difco)
56 г 24 г 4 г
0,8 г 0,8 г
8 г
Дрожжевой экстракт (Difco)
4 г
1. Ратворите перечисленные ингредиенты в 1 л воды и доведите pH раствора до 7,2 с помощью NaOH.
2. Автоклавируйте 15 мин при 0,7 атм.
3. Чтобы получить среду SP1, разведите среду 4XSP в четыре раза стерильной водой и добавьте глюкозу до 0,5% (по весу), тимин до 100 мкг/мл и необходимые аминокислоты до 50 мкг/мл.
