Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
238
Глава 1
В качестве минимальной среды используют среду Спицай-зена [54]; при получении компетентных клеток в нее вносят казаминокислоты и глюкозу. Среда Спицайзена содержит в 1 л:
2 г (NH4)2S04; 18,3 г К2НР04-ЗН20; 6 г КН2Р04; 1 г т^ехза-мещенного цитрата натрия (двухводного) и 0,2 г MgS04'7H20; pH 7,2.
Многие штаммы бацилл, широко применяемые в молекулярно-генетических экспериментах, плохо растут на минимальных средах без добавления казаминокислот и дрожжевого экстракта (см. табл. 6); исключение составляют бактерии CU403 [18], используемые для получения миниклеток, — этот штамм хорошо растет на минимальной среде, дополненной лишь 0,5%-ной глюкозой (по весу), метионином (100 мкг/мл) и тимином (100 мкг/мл).
В противоположность Е. coli В. subtilis — облигатный аэроб и требует хорошей аэрации на всех этапах культивирования. При выращивании в конических колбах объем культуры не должен превышать 10% от объема колбы. Для более эффективной аэрации часто применяются качалочные колбы, имеющие выступы на стенках. Жидкие культуры Bacillus, оставленные без встряхивания более чем на несколько минут, часто лизируются. Нормальная температура инкубации +37°С.
3. Выделение плазмидной ДНК
3.1. Препаративное выделение плазмидной ДНК
Для выделения плазмидной ДНК можно использовать модифицированные методы выделения плазмид из Е. coli. Ниже приведен метод выделения плазмид из клеток В. subtilis, основанный на разработке Бирнбойма и Доли [55]; приготовление необходимых растворов описано в табл. 5.
1. Нарастите 250 мл культуры в VY- или L-бульоне при 30" и интенсивной аэрации в двухлитровой колбе в течение 18 ч. В качестве инокулята используйте несколько колоний, взятых со свежей чашки.
2. Осадите клетки центрифугированием в роторе Sorvall GSA (или эквивалентном) при 10 000 об/мин в течение 10 мин.
3. Ресуспендируйте осадок в 4,8 мл раствора I, содержащего 2 мг/мл лизоцима. Инкубируйте 5 мин при 30° и затем 10 мин во льду.
4. Добавьте 9,6 мл раствора II. Перемешайте встряхиванием и оставьте на 5 мин во льду.
5. Добавьте 7,2 мл раствора III. Встряхните и оставьте на 20 мин во льду.
6. Центрифугируйте смесь при 4° С в роторе Sorvall SS 34 (или эквивалентном) при 12 000 об/мин в течение 15 мин.
Методы клонирования в бациллах___________________ 239
-х---- аналитического выделений
Таблица 5. Расткрры для препаративного и
1 плазмидной ДНК
Раствор 1 \
Г люкоза ' 9,9 г (50 мМ)
ЭДТА 3,7 г (10 мМ)
Трис 3,0 г (25 мМ)
Воды до 1 литра; довести pH до 8,0, добавляя НС1.
Раствор II
NaOH 8,0 г (0,2 М)
SDS 10,0 г (1% вес/объем)
Воды до 1 литра. Использовать свежеприготовленный раствор.
Раствор III
Ацетат натрия pH 4,8 (3 М)
246 г/литр. Доводить pH
до 4,8, добавляя уксусную кислоту
Раствор IV
Ацетат натрия 8,2 г (0,1 М)
Трис 6,05 г (50 мМ)
Воды до 1 литра; довести pH до 8,0, добавляя НС1
7. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и добавьте 13 мл изопропанола. Перемешайте и оставьте при —20 °С на 15 мин для того, чтобы сформировался осадок нуклеиновых кислот.
8. Осадите нуклеиновые кислоты центрифугированием при' 4°С в роторе Sorvall SS 34 (или эквивалентном) при 15 000 об/мин в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость.
9. Высушите осадок в вакуумном эксикаторе и затем ресуспендируйте в 4,3 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС1; 1 мМ ЭДТА; pH 7,5).
10. К 3,9 мл суспензии добавьте 3,85 г CsCl. После того как весь CsCl растворится, внесите 160 мкл 1%-ного раствора (по весу) этидиумбромида.
11. Перенесите раствор в ультрацентрифужные пробирки с крышками типа Beckman и наслоите минеральное масло до верха пробирки. Закройте пробирки, руководствуясь инструкцией производителя, и центрифугируйте при 40 000 об/мин в течение по меньшей мере 18 ч при 15 °С в роторе Beckman Ti 70 {можно использовать эквивалентные угловые и вертикальные роторы других фирм).
3.2. Метод выделения небольших количеств плазмидной ДНК
Небольшие количества плазмидной ДНК можно получить с помощью процедуры Бирнбойма и Доли [55]. Однако выход может оказаться неудовлетворительным (особенно для видов
240
Глава 1
бацилл, отличных от В. subtilis) в тех случаях, когда используется ночная культура. Гораздо лучший результат получится, если инокулировать жидкую среду свежими колониями и инкубировать непродолжительное время — всего 2—3 ч — до достижения оптической плотности (ОП), приблизительно равной 1.
