Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Мол. масса Родительские плазмиды Маркеры1)
В. subtilis Е. coli
pHV14 4,6 pC194, pBR322 Cm Ap, Cm [3]
pHV33 4,6 pC194, pBR322 Cm Ap, Tc, Cm [3]
pVH23 6,1 pC194, pBR322, pT127 Tc, Cm Ap, Cm [47]
pOG2165 5,0 pC194, pU194, ген Ap, Cm Ap, Cm [51]
pen-r B. licheniformis
pJK3 5,0 pBS161-l, pBR322 Tc Ap, Tc [52]
pCPP-3 3,7 pBR322, pUBllO, pC194 Km Km [53]
') См. примечания к табл. 2.
леотидная последовательность плазмид рС194 и рЕ194 опубликована [20, 21]. Рестрикционные карты этих двух плазмид, а также плазмиды pUBllO представлены на рис. 1—3.
Особого внимания заслуживают гибридные или химерные плазмиды, способные реплицироваться как в клетках Е. coli, так и в клетках В. subtilis. Они представлены в табл. 4. До-
Методы клонирования в бациллах
235
Рис. 1. Физическая карта плазмиды рЕ194 [20]. Стрелками обозначены открытые рамки считывания. Рамка В соответствует гену егтС, который кодирует метилазу, обеспечивающую устойчивость к эритромицину. Область, ответственная за репликацию, расположена во фрагменте Taql-В; в мутантах рЕ194, отличающихся количеством копий, обнаруживается точечная нуклеотидная замена в рамке Е. Точка начала репликации (в направлении против часовой стрелки) локализуется в участке 0,35—0,45 [75].
Рис. 2. Физическая карта плазмиды рС194 [21]. Стрелками показаны открытые рамки считывания. Рамка В кодирует хлорамфеникол-ацетилтрансферазу. Последовательности, участвующие в репликации, локализованы в рамке С.
вольно часто начальные этапы клонирования гораздо легче осуществить, используя в качестве бактерии-хозяина Е. coli, а затем ввести рекомбинантный материал в В. subtilis.
Описано множество примеров нестабильности плазмид, особенно среди производных рС194 [2, 22—24]. Ответственная за
236
Глава 1
.BamHI
Рис. 3. Физическая карта плазмиды pUB 110 [74]. Рестрикционный сайт Bglll находится в области, определяющей устойчивость к канамицину; границы соответствующего гена не определены, точка начала репликации (в направлении против часовой стрелки) локализуется в районе 3,2 [75].
нестабильность область этой плазмиды, возможно, содержит транспозоноподобный элемент, несущий инвертированную повторяющуюся последовательность [24]. Другой вероятной причиной нестабильности некоторых плазмид является наличие небольших участков гомологии, служащих горячими точками рекомбинации [7, 25]. Среди рекомбинантных плазмид далеко не все характеризуются нестабильностью (см., например, 4), но, учитывая высокую частоту рекомбинации, характерную для В. subtilis, при проведении экспериментов с рекомбинантными молекулами важно сделать все, чтобы экспрессия чужеродных генов находилась под строгим контролем. В противном случае клоны, рост которых не ингибируется чужеродными белками, могут очень быстро вытеснить родительский штамм. Трудностей, возникающих из-за рекомбинации плазмидных промоторов с хромосомными гомологами, можно избежать, используя промоторы неродственных видов (ДНК многих видов Bacillus обнаруживают лишь весьма незначительную взаимную гомологию [26]), а также фаговые промоторы (см. табл. 4).
Методы клонирования в бациллах
237
Ряд бациллярных плазмид был специально сконструирован для клонирования и селекции промоторов (например, рСРР-3, табл. 4).
2.3. Фаги и плазмиды Bacillus
Разработано несколько фаговых и фагово-плазмидных векторов, в том числе на базе р 11 [27, 28], 95105 [28, 30], SP02 [31, 32] и SPP1 [33]. Один из примеров их использования — клонирование генов амилазы [28, 30].
2.4. Хранение штаммов
Нестабильность некоторых бациллярных плазмид указывает на необходимость закладывать штаммы на хранение немедленно после того, как они были выделены, — иначе вы рискуете продолжать работу с уже измененными плазмидами. Безусловно, лиофилизация — превосходный метод хранения культур в течение длительного времени. Однако для повседневной работы более удобен метод замораживания штаммов при —70° в L-cpe-де, содержащей 10% (по объему) глицерина: 2 мл среды ино-кулируют бактериальной массой со свежей чашки до концентрации по меньшей мере 1010 клеток/мл, после чего пробирки замораживают в спиртовой бане с сухим льдом и помещают в низкотемпературную морозильную камеру для дальнейшего хранения. Одну и ту же пробирку можно многократно использовать для засева чашек, соскабливая петлей небольшое количество материала с поверхности замороженного содержимого пробирки и рассевая его на агаризованной среде. Важно следить за тем, чтобы содержимое пробирки оставалось замерзшим во время отбора образца: повторные циклы замораживания — оттаивания приводят к снижению жизнеспособности культуры и селекции вариантов.
2.5. Среды для культивирования
В качестве богатой среды для выращивания бацилл вполне пригодны L-бульон и L-arap, широко используемые для культивирования Е. coli. Для некоторых штаммов более быстрый рост обеспечивает твердая среда на основе кровяного агара с трип-тозой и жидкая VY-среда [41]. Кровяной агар с триптозой производится фирмой Difco. Для заливки чашек его следует развести до концентрации 3,3% (по весу) и простерилизовать автоклавированием. VY-бульон готовят из телячьей вытяжки (Difco)—2,5% (по весу) и дрожжевого экстракта — 0,5% (по весу) и стерилизуют автоклавированием.
