Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТЕ ТЕМПЕРАТУРЫ
В этом варианте трубку, в которой осуществляется разделение, заполняют обычным буферным раствором, но верхнюю ее часть термостатируют при значительно более высокой температуре, чем нижнюю [565, 785, 786]. Поскольку степень диссоциации слабого основания или кислоты зависит от температуры, одновременно с градиентом температуры формируется и градиент pH. Для стабилизации зон против конвекции применяют либо градиент плотности, либо вращение трубки, в которой проводят фракционирование. Этот метод полезен в тех случаях, когда изоэлектрические точки разделяемых белков близки друг другу, потому что таким путем можно создать градиент в пределах лишь одной единицы pH. Возможность применения ИЭФ в градиенте pH, сформированном под действием температуры, ограничена высокой чувствительностью большинства белков к нагреванию.
ГРАДИЕНТ pH, СОЗДАВАЕМЫЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО ГРАДИЕНТА КОНЦЕНТРАЦИЙ
Совершенно новый подход к получению градиентов pH разработали Троицкий и др. [1301]. Эти авторы использовали обычные буферные растворы в градиенте концентраций органических растворителей, таких, как диоксан, этанол и глицерин, или полиопиртов, например маннита или сорбита. В присутствии этих веществ изменяются константы диссоциации компонентов буферного раствора, и, таким образом, посредством вспомогательного градиента концентраций удается создать градиент pH в диапазоне примерно 1,5 единицы pH. Применив боратный буфер в смешанном градиенте концентраций глицерина (0—5%) и сахарозы (0—30%), авторы получили градиент pH между pH 7 и 8,6 и провели в нем ИЭФ гемоглобинов. Аналогичным образом был сформирован градиент pH в интервале pH 4,5—5,8 в ацетатном буфере при изменении в нем содержания глицерина от 0 до 90%. Градиенты pH такого типа оказались стабильными на протяжении длительного времени в условиях проведения ИЭФ.
1.12.2, Методические приемы изоэлектрического фокусирования
С методической точки зрения наиболее важной проблемой, возникающей при изоэлектрическом фокусировании, является стабилизация зон против конвекции. Этого можно добиться несколькими путями, а именно проводя ИЭФ:
1) в колонках ,с устойчивым градиентом плотности нейтральных и инертных веществ, чаще всего сахарозы;
2) в растворах амфолитов-носителей, не содержащих каких-либо иных добавок;
3) в гелях (обычно в полиакриламидном геле);
4) в тонком слое гранулированного поддерживающего материала.
Большинство из перечисленных выше приемов пригодно как для аналитических, так и для препаративных целей.
ЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТАХ ПЛОТНОСТИ
При использовании градиента плотности для стабилизации зон в ходе ИЭФ можно применять те же или аналогичные приборы, которые предназначены для зонального электрофореза в градиенте плотности. Основная трудность при их конструировании состоит в том, что в процессе электролиза на электродах образуются пузырьки газа, мешающие нормальному разделению анализируемых веществ. Для преодоления этой трудности существуют два способа: электроды пространственно отделяют от остальной части прибора или изготавливают их из специальных сплавов благородных металлов, на которых пузырьки газа не образуются. В этой главе будет оггисано несколько аппаратов обоих типов, употребляемых при ИЭФ.
Очень важно также, особенно в крупномасштабных препаративных опытах, обеспечить хорошее термостатирование колонок с градиентом плотности. Дело в том, что местные повышения температуры, возникающие из-за неодинаковой проводимости амфолитов, расположившихся в соответствии с их изо-электричеокими точками, могут изменить плотность отдельных слоев и тем самым поставить под угрозу стабильность всего градиента плотности.
Первые опыты по ИЭФ с использованием амфолитов-ноои-телей были выполнены в приборе, созданном Свенссоном и др. [1262, 1348]. Позднее он был слегка модифицирован с целью улучшить стабилизацию температуры. В настоящее время фирма LKB (Швеция) (Выпускает приборы этого типа двух размеров емкостью 110 и 440 мл. Схематическое изображение такого аппарата представлено на рис. 53. Разделение проводят в стеклянной вертикальной колонке, имеющей наружную рубашку и внутреннюю охлаждающую трубку для обеспечения хорошего термостатирова-ния. Один из электродов находится в электродной трубке, снабженной на ее нижнем конце запирающим клапаном и расположенной коаксиально во внутренней охлаждающей трубке. Другой электрод (в виде кольца) укреплен в верхней части цилиндрической разделительной камеры.
Риг. 53. Прибор, разработанный Све,нс-соном специально для изоэлектриче-ского фокусирования в градиенте плотности сахарозы [1262,, 1348]. (Воспрошводится из рекламного проспекта фирмы LKB-Producter.) Фирма LKB-Producter производит такие приборы двух размеров: емкостью 440 и 110 мл. Описание устройства прибора и его применение см. в тексте. 1 — верхний электрод; 2 — внутренняя охлаждающая рубашка; 3 — наружная охлаждающая рубашка; 4 — кольцеобразная камера для разделения; 5 — нижний электрод; 6 — запирающий клапан; 7 — выводной капилляр.
