Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Прерывистая электрофоретическая элюция. Чтобы избавиться от разведения выделяемых фракций, некоторые исследователи предпочитают использовать метод прерывистой элюции [175, 666, 1083, 1128]. В данном случае в ходе опыта электрофорез неоднократно прерывают и элюат каждый раз удаляют. Пай-дак [958] описал очень простой прибор, предназначенный для этой цели (рис. 47). Гель получают в стеклянной трубке длиной 70 мм и диаметром 30 мм, охлаждаемой снаружи электродным буфером. Через середину геля проходит внутренняя трубка длиной 100 мм и диаметром 5 мм, оканчивающаяся в элюционной камере, ограниченной снизу диа-
лизной мембраной. Периодически через эту
трубку пипеткой отсасывают буфер, содержащий элюированные белки, а в камеру вновь заливают свежий буферный раствор. С помощью этой
Рис. 47. Схематическое изображение прибора Пайдака [958]. / — буфер; 2 — гель; 3 — элюционная камера; 4 — диализная мембрана.
Рис. 48. Приспособление для элюции, используемое при препаративном микроэлектрофорезе в полиакриламидном геле [809]. 1 — разделяющий гель;
2 — соединительная тайгоновая трубка; 3—полиэтиленовые трубки для элюирующего буфера; 4 — элюционная камера; 5— поддерживающий гель. Стрелками показано направление тока элюирующего буфера.
системы автору удалось разделить 1 мл плазмы крови (70 мг белка) на 20 относительно гомогенных фракций. За один прием можно было выделить ai-антитрипсин в активной форме, не содержащий примеси альбумина.
Стегеманн [1230] разделял белки на пластине геля и элюировал их через определенные интервалы времени, автоматически регулируемые по заранее заданной программе.
Еще один вариант препаративного электрофореза в полиакриламидном геле состоит в том, что макромолекулы, мигрирующие через полиакриламид, переходят в раствор градиента плотности сахарозы, который после окончания электрофореза фракционируют. Из полученных фракций можно легко выделить нужные компоненты [1150, 1160]/
Рис. 49. Схематическое изображение прибора для препаративного микроэлектрофореза е полиакриламидном геле [1358]. 1 — полимеризованный гель; 2 — насос, 3 регистратор УФ-светга; 4 — направление тока буфера из нижнего
электродного сосуда.
Для улучшения разделения в некоторых случаях целесообразно использовать систему, в которой буфер течет в противоположном направлении по сравнению с движением компонентов разделяемой смеси [253, 1182].
Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле для разделения очень больших количеств веществ. Были сконструированы приборы, дающие возможность фракционировать 1 г белка [571, 1230]. Бойде и Ремтулла [158] разработали метод, позволяющий проводить непрерывное электрофоретическое разделение белков. Принцип его заключается в том, что гель в результате постоянного медленного вращения смещается в направлении, перпендикулярном движению веществ под действием электрического поля. За день удается фракционировать до
1 г белка.
Приборы для препаративного микроэлектрофореза. Описано несколько типов приборов для выделения белков и нуклеиновых кислот в микрограммовых количествах [617, 809] (рис. 48); [1060, 1358] (рис. 49). Они не очень сложны и могут оказаться полезными на стадии окончательной очистки макромолекул.
L12. Изоэлектрическое фокусирование
Изоэлектрическое фокусирование — это один из новейших методов разделения молекул, основанных на их поведении в электрическом поле. Во время изоэлектрического фокусирования между анодом и катодом создается градиент pH. Заряженные молекулы, которые вначале равномерно распределены в среде или нанесены в виде одной полосы, движутся в соответствии с их фактическим зарядом в направлении противоположно заряженного электрода. Если эти молекулы амфотерны, то при перемещении в градиенте pH их суммарный заряд будет непрерывно меняться до тех пор, пока они не достигнут положения, где он станет равным нулю. Это произойдет в том месте градиента pH, в котором значение pH окажется равным изо-электричеокой точке молекулы. Таким образом, молекулы, имеющие одинаковую изоэлектрическую точку, сконцентрируются в узкой зоне. Если градиент pH стабилен, то дальнейших изменений происходить не будет и молекулы останутся сконцентрированными, так как их диффузии препятствует электрическое поле. Чаще всего этот процесс называют изоэлектрическим фокусированием (ИЭФ), однако в литературе можно встретить и такие термины, как изоэлектрическое фракционирование, изоэлектрическое разделение, изоэлектрическая конденсация и стационарный электролиз.
Применение этого принципа впервые было описано в 1912 г. японскими химиками Икеда и Суцзуки [607], выделившими глутаминовую кислоту из гидролизата растительных белков.
Действительными же изобретателями ИЭФ можно считать Уильямса и Уотермана [1428], которые в 1929 г. четко сформулировали его основные принципы. Однако использованный ими многокамерный аппарат не мог успешно конкурировать с другими электрофоретическими методами разделения белков, поскольку проблема создания стабильного градиента еще не бы-ла решена.
