Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Для извлечения макромолекул из сегментов полиакриламидного геля можно воспользоваться электрофорезом. Сегменты кладут в диализный мешок и содержащиеся в них биополимеры под действием электрического поля переходят в раствор, который пипеткой отстаивают из мешка [451]. Другой способ состоит в том, что сегменты геля помещают в стеклянную трубку и заключают их в новый полиакриламидный гель низкой концентрации. На нижнем конце трубки закрепляют небольшой диализный мешочек и проводят электрофорез, в результате чего белки мигрируют через разбавленный гель и попадают в этот мешочек [763, 1246]. Для электроэлюции ДНК из сегментов геля [1479] был применен прибор, предназначенный для обесцвечивания белков [1063].
Электрофорез в колонке полиакриламидного геля. Общий вид прибора показан на рис. 45. Колонка расположена между двумя электродными сосудами. К нижней части геля примыкает элюционная камера, в которую выходят разделившиеся компоненты. Прибор механически поддерживает гель и в большинстве случаев обеспечивает эффективное охлаждение.
Некоторые типы устройств снабжены водяной рубашкой [450, 715], а кроме того, и центральным охлаждающим пальцем [666]. Иногда применяют полиакриламидный гель в форме полого цилиндра, расположенный между двумя вставленными друг в друга охлаждаемыми трубками [151, 320]. Центральную часть колонки с полиакриламидным гелем можно охлаждать также холодным элюирующим буфером, протекающим
через гель из элюционной камеры к коллектору фракций [253, 648, 803].
При наливании в колонку раствора акриламида на место элюционной камеры устанавливают специальное приспособление либо закрывают нижнее отверстие резиновой или любой другой пробкой.
В настоящее время в продаже имеется большое число разных типов приборов.
Непрерывная электрофоретическая элюция. Одним из наиболее важных узлов в приборах для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле такого типа является элюционная камера, образующаяся между нижней поверхностью геля и стенками нижней части прибора. При использовании подобных приборов возникают следующие трудности:
1. Гель может выпячиваться в камеру из-за того, что в его средней части температура выше, чем у охлаждаемой поверхности, а также из-за накапливания ионов или сжатия мицелл на его конце, обращенном к аноду Г571 648 Рис' 45- Схематическое изображение
666 11281 * прибора типа МК II фирмы Shandon
о лд ' для препаративного электрофореза в
г. Механические подлож- полиакриламидном геле,
ки, поддерживающие гель снизу, иногда мешают выходу
из 'него белков. Чтобы попытаться избавиться от этого недостатка, разные авторы использовали следующие поддерживающие материалы: диффузионные диски [33], грубые стеклянные фильтры [322], губку [1050] >и фильтровальную бумагу [569].
3. Диализная мембрана, отделяющая элюционную камеру от электродного сосуда, может адсорбировать белки или инактивировать их при крайних значениях pH, возникающих на ней вследствие эффекта Бете — Торопова [575]. В то же время
Рис. 46. Схематическое изображение прибора Вельцена и Зюдвега [1406] в продольном разрезе. На вставке показана элюционная камера. 1 — входное отверстие для охлаждающей жидкости; 2 — выходное отверстие для охлаждающей жидкости; 4 — входное отверстие для буфера, циркулирующего в электродном сосуде 6 и выходящего через отверстие 14\ 5 — охлаждающий
палец; 6, 8 — электродные буферные сосуды; 7 — мелкие отверстия, обеспечивающие циркуляцию буфера в электродном сосуде 6 без перемешивания пробы, нанесенной на гель; 9 — электроды; 10 — полиакриламидный гель (пробу на его поверхность наносят через патрубок 3); 11— входное отверстие для буфера, поступающего в элюционную камеру 16 объемом 0,1 мл (выход элюата через отверстие 18), и для буфера, циркулирующего & электродном сосуде 8 и вытекающего через трубку 13; 12 и 17 — пластмассовая пробка; 15 — диск из пористого стекла. Наибольшая высота геля составляет 5,2 см, что соответствует объему 33 мл и площади поверхности 18 см2.
вышедшие из колонки белки располагаются на диализной мембране тонким слоем, и потому менее плотный элюирующий буфер может протекать над ним, не увлекая за собой белки. Чтобы этого не происходило, используют элюционную камеру [1255], в которую буфер поступает снизу и переносит слой белков вверх. С этой же целью создана камера другой конструкции, откуда буфер вытекает через центральное отверстие [112].
Иертен и др. [571] совсем исключили диализную мембрану, применив вместо нее шарики из агарозы. Другие авторы [1406] заменили мембрану специальным устройством в форме воронки (рис. 46], что позволило создать элюционную камеру объемом 0,1 мл и обеспечить концентрирование разделяемых компонентов в лроцессе их миграции.
Довольно простую и эффективную камеру для элюции сконструировал Турнер [1315], воспользовавшись шприцами, сделанными из (полипропилена.
Недостатки непрерывной элюции заключаются в том, что белки (особенно движущиеся более медленно) элюируются в разбавленном виде и что некоторые из них адсорбируются на трубках, по которым элюат поступает к регистратору поглощения ультрафиолетового света и коллектору фракций. Страух [1239] создал прибор, который одновременно регистрирует ультрафиолетовое поглощение и управляет скоростью элюции, вследствие чего устраняется разведение выходящих из колонки веществ. Описана также [811] методика элюирования белков при помощи буфера, циркулирующего по заранее заданной программе.
