Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 42

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 185 >> Следующая

Выход материала, полученного после электрофореза, определяется многими причинами. Потеря белков может произойти вследствие их сорбции на геле, стенках прибора или элементах элюционной камеры [658]. Сорбция белков полиакриламидным гелем завиоит от количества нанесенного материала, а также от pH и концентрации геля. Ее нельзя предотвратить добавлением формамида, тиогликолата, сахарозы или полиаспараги-новой кислоты. Однако если заранее ввести в гель (желательно при полимеризации) посторонние белки, то белоксвязываю-щая способность акриламида оказывается насыщенной, и тогда удается частично или полностью избежать адсорбции исследуемых белков. Для этой цели особенно тгригодны белки с высокой подвижностью (глюкагон, бацитрацин, В-цепь инсулина) .
Для визуального обнаружения сорбированных белков рекомендуется по окончании электрофореза окрасить всю колонку с гелем (инструкция к прибору для препаративного диск-электрофореза фирмы Canal Industrial Corp., 1968). Для этого вместо верхнего и нижнего буферов в электродные сосуды наливают 7%-ную уксусную шслоту, на гель наслаивают около 2 мл 0,5%-ного раствора амидового черного или проционового синего в 15%-ной уксусной кислоте и продолжают электрофорез до тех пор, пока краситель не пройдет через всю колонку, оставляя окрашенные полосы в прозрачном геле.
Выход белков 'варьирует в пределах от 30 до 90%.
Артефакты, возникающие при препаративном гель-электро-uфорезе. Причиной артефактов могут быть рибофлавин и бром-4>еноловый синий [1407], способные инактивировать ферменты, поэтому их не следует применять. Примеси, содержащиеся в используемых реактивах, часто элюируются вместе с макромолекулами. Необходимо исключить условия, приводящие к осаждению белков (например, их слишком высокая концентрация в пробе). При исследовании ферментов нежелательно проводить очень длительный электрофорез.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕЛЯ
Приготовление полиакриламидного геля описано в разделе, посвященном аналитическому электрофорезу. Важно отметить, что дегазирование раствора акриламида до добавления к нему персульфата необходимо выполнять особенно тщательно, так как наличие пузырьков в геле нарушает условия проведения электрофореза. Полимеризация геля должна происходить при той же температуре, при которой будет проводиться разделение. Для получения узких зон нужно, чтобы поверхность геля была совершенно гладкой, поэтому воду на раствор акриламида наслаивают как можно аккуратнее. Если же для внесения пробы попользуют канавку, то ее формируют при помощи специального шаблона [320]. Готовый гель выдерживают до употребления не менее 1 ч или, что еще лучше, оставляют на ночь. Для удаления несущих заряд примесей и непрореагировавших в процессе полимеризации реактивов рекомендуется проводить в течение 1 ч ттреэлектрофорез.
Приготовление пробы. Обычно препаративный электрофорез в полиакриламидном геле не используют в качестве одного из начальных этапов в очистке белков и нуклеиновых кислот. Для предварительного грубого фракционирования компонентов омесей применяют методы хроматографии, высаливания или осаждения. Чтобы провести электрофоретическое разделение, пробу необходимо сконцентрировать до 5 мл для однородной системы и до 10—20 мл для неоднородной. От избытка солей можно избавиться при помощи диализа или гель-фильтрации. Концентрация солей в исследуемом растворе должна быть такой же, как в буфере концентрирующего геля. Если же этот гель не используется, то пробу диализуют против буфера разделяющего геля, разведенного 'В 5 раз. Медленное вхождение пробы в гель во время электрофореза свидетельствует о слишком высокой концентрации солей. Любой осадок, присутствующий в пробе, следует удалять центрифугированием или фильтрованием через миллипоровый фильтр, так как он может закупорить разделяющий гель.
ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТИВНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Экстрагирование сегментов геля. Наиболее простой метод препаративного электрофореза в полиакриламидном геле — это использование большого числа таких же столбиков геля, какие применяются в аналитических целях. Образец наносят на эти столбики и проводят электрофорез, после чего один из них окрашивают или проявляют каким-либо иным способом. Зону,
содержащую отделившийся компонент, вырезают, измельчают в гомогенизаторе или путем продавливания через шприц для подкожных инъекций, а затем элюируют подходящим растворителем [1139, 1246, 1479].
Получение белков в препаративных количествах было осуществлено при помощи электрофореза на пластине из полиакриламидного геля [1229]. Для выявления пятен белков тонкий слой геля-окрашивали, обнаруженные пятна вырезали и подвергали элюции.
Элюцию можно проводить путем простой диффузии с использованием соответствующего буфера [763, 1139] или 70%-ной муравьиной кислоты [1360], если необходимо исследовать аминокислотный состав выделенных белков. Недостатком этого метода является малый выход белков.
Янг и Янг [1474] отделили РНК от примеси растворимого акриламида, осадив ее цетилтриметила-'ммонийбромидом. Обычно применяемые для этих целей осаждающие агенты оказались неприемлемыми, так как в этаноле выпадал в осадок также и акрил амид, а трихлоруксусная и хлорная кислоты вызывали частичный гидролиз РНК.
Предыдущая << 1 .. 36 37 38 39 40 41 < 42 > 43 44 45 46 47 48 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed