Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Таким путем удаляют низкомолекулярные соединения и фиксируют полинуклеотиды. Высушенный индикаторный агарозный гель подвергают радиоавтографии.
Рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы можно обнаруживать, используя их природные субстраты (РНК и ДНК) или применяя в качестве субстратов синтетические рибо- и дезоксирибо-нуклеотиды.
Вольф [1442] инкубировал гели с низкомолекулярной РНК. Затем гели окрашивали красителем для РНК. После обесцвечивания гелей положение рибонуклеазной активности определяли по появлению менее интенсивно окрашенных полос. Быстрый метод подобного типа описан Уилсоном [1431].
Поскольку высокомолекулярные РНК не мигрируют в полиакриламидных гелях, их включение в состав геля не вызывает каких-либо осложнений. РНК добавляют к гелеобразующему раствору и электрофорез проводят обычным способом. После электрофореза гели инкубируют в буферном растворе, фиксируют и окрашивают красителем для РНК. После обесцвечивания гелей появляются менее интенсивно окрашенные полосы, указывающие местонахождение ферментативной активности [1057]. В качестве субстрата в гель включают и полиуридиловую кислоту в конечной концентрации 0,05% .[780]. После электрофореза при pH 9,5 гели инкубируют 2 ч в 7%-ной уксусной кислоте. В течение этого времени pH геля снижается почти до 2,0. Таким образом, ферменты с различными оптимумами pH могут расщеплять синтетические полинуклеотиды, прежде чем подвергнуться инактивации. Затем гели окрашивают, оставляя их на ночь в 1%-ном растворе пиронина в 7%-ной уксусной кислоте. Обесцвечивание гелей проводят в 7%-ной уксусной кислоте.
Дезоксирибонуклеазы можно обнаруживать так же, как и рибонуклеазы. Бойд и Митчелл [156] добавляли к акриламиду субстрат (нативную или денатурированную ДНК) перед полимеризацией геля. После электрофореза гели инкубировали и окрашивали присутствующую в них ДНК метиловым зеленым. Этот метод позволяет обнаружить 250 пг панкреатической ДНКазы. При сканировании гелей на денситометре при длине волны 260—265 нм окрашивание гелей можно не проводить [155].
Для локализации эндодезоксирибонуклеазной активности Грдина и др. ,[471] разработали чувствительный метод, позволяющий определять 5 пг панкреатической ДНКазы I. В качестве субстрата в полиакриламидный гель включали 7 мкг/мл ковалентно замкнутой двухцепочечной ДНК или открытой кольцевой ДНК. Электрофоретическое разделение проводили при pH 8,9. После электрофореза гели инкубировали в охлажденном 0,1 М буфере трис-НС1 (pH 7,0), содержащем 0,005 М MgCb. Затем
их переносили в предварительно подогретый буфер и в течение соответствующего времени инкубировали при 37 °С. После инкубации гели окрашивали при 4°С в темноте бромистым этидием (1 мкг/мл), растворенным в 0,01 М буфере трис-HCI, с 0,005М MgCl2 и 5 мМ ЭДТА (pH 7,8) [966]. Флуоресценцию гелей, окрашенных бромистым этидием, определяли с помощью сканирующего спектрофлуориметра. Наиболее чувствительным был тест с использованием в качестве субстрата кольцевой ковалентно замкнутой ДНК, поскольку в этом случае для увеличения связывания бромистого этидия достаточно было одного разрыва в молекуле ДНК.
Как субстрат для дезоксирибонуклеазы применяют также поли-с1(А-Т), которую добавляют к акриламиду перед полимеризацией геля [780]. После инкубации гели окрашивают метиловым зеленым.
Используя ДНК-содержащие микрогели и галлоцианин как краситель, можно обнаружить 0,1 нг дезоксирибонуклеазы [1482]. Применение для фракционирования дезоксирибонуклеаз полиакриламидного геля, содержащего 3Н-ДНК, улучшает результаты их количественного определения. После электрофореза гели разрезают и инкубируют в соответствующем буфере. Ферментативную активность определяют по количеству выходящих в среду радиоактивных фрагментов. Величина этой радиоактивности пропорциональна количеству фермента в пределах от 10 до 0,1 нг, а воспроизводимость определений составляет ±5%.
И.6.5. Гидр о л азы
Эстеразы, гликозидазы, фосфатазы и пептидазы легко можно обнаружить после электрофореза с помощью реакции азосочетания. В качестве субстратов используют соответствующие производные а- или р-нафтола; освободившийся под действием фермента нафтол вступает в реакцию сопряжения с солью диазония с образованием окрашенного соединения в зоне локализации фермента. Для выявления указанных выше ферментов применяют как метод одновременного сочетания, так и метод сочетания после инкубации. Однако первый метод дает, как правило, более четкие результаты. Хотя с точки зрения реакции азосочетания производные р-нафтолов имеют преимущества, скорость их ферментативного расщепления меньше, чем у а-нафтолов. Чаще всего в реакции азосочетания используют такие стабильные соли диазония, как прочный синий В или RR, прочный гранатовый GBC и прочный черный К.
В некоторых случаях гидролазы выявляют с помощью хромогенных (например, нитрофенильных производных), флуоро-
генных (например, 4-метилумбеллиферильных производных) или природных субстратов (крахмала или белков).
Для локализации карбоксиэстераз применяют, как правило, метод одновременного сочетания с использованием эфиров (ацетатов, пропионатов или бутиратов) а- или 0-нафтолов [823]. ¦Субстрат растворяют в ацетоне и затем добавляют к буферному ^раствору, сбдержащему соль диазония. В качестве буфера часто ¦используют трис-НС1 (pH 7,4) в конечной концентрации 0,05— fi,2 М. Концентрации субстрата и соли диазония в реакционной смеси составляют около 1 мг/мл и 0,5—0,7 мг/мл соответственно. Этот метод пригоден также для обнаружения липазы, если в качестве субстрата используют нафтилнонаноат, а в качестве сопрягающего агента — соль прочного синего ВВ [2].
