Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Нитритредуктазу идентифицируют после электрофореза в пог лиакриламидном геле, инкубируя его при 27 °С под вакуумом в трубке Тунберга, содержащей NaN03 и бензиловый виологен,
восстановленный водородом в присутствии палладия. Через 1—
3 ч в геле на синем фоне появляются бесцветные полосы, возникновение которых обусловлено реокислением бензилового виологена. Окраска фона непрочна, поэтому для получения стойкой энзимограммы гели переносят в другую вакуумирован-ную трубку Тунберга, содержащую раствор хлористого трифе-: нилтетразо'лия, который превращается в нерастворимый формазан. Посл'е такой обработки зоны, содержащие фермент, выявляются в виде неокрашенных полос на красном фоне [590].
II.6.4. Трансферазы
Некоторые фосфотрансферазы можно обнаружить с помощью дополнительных ферментов, которые превращают продукты, об-; разующиеся под действием трансфераз, в соединения, служащие хорошими субстратами для дегидрогеназ. Активность дегидрогеназ определяют одним из указанных выше методов. Некоторые примеры подобных определений приведены в табл. 8.
Недавно был описан прямой метод локализации протешки наз [1010]. Гели помещают на хроматографическую бумагу ватман ЗММ, предварительно насыщенную 100 мМ буфером трис-НС1 (pH 7,5), содержащим б мМ MgCU, 25 мкМ 32Р-АТР (1 мкКи/нмоль) и фосвитин (5 мг/мл). Этот «сэндвич» инкубируют 20 мин при комнатной температуре и затем останавливают реакцию, погружая бумагу в 20 мл охлажденного раствО' ра (приготовленного непосредственно перед использованием), содержащего 10%-ную ТХУ и кремневольфрамовую кислоту (9:1, по объему), а также 1 мМ немеченый АТР. Бумагу про-* мывают, сушат, а затем сканируют для определения радиоактивности.
Глюканфосфорилазу (а-1,4-глюканортофосфат-гликозил-трансферазу) можно обнаружить либо путем осаждения неорганического фосфата ионами кальция с последующим превращением его в фосфат свинца, а затем в сульфид свинца ![282, 539, 1476], либо с помощью реакции между гликогеном и иодом [399].
Модификация методов последнего типа была использована для определения константы диссоциации глюканфосфорилазы [1271]. После электрофореза полиакриламидные гели инкубируют в 2 М Иа-ацетатном буфере (pH 5,9), содержащем 0,5 мг/мл АМФ и 2,5 мг/мл глюкозо-1-фосфата; гликоген добавляют либо перед полимеризацией геля, либо к инкубационной среде. После инкубации при 37 °С в течение 5—10 мин (в завит симости от количества присутствующего фермента) гели погружают в раствор KI—Ь в 7%-ной уксусной кислоте. Появление фиолетовых полос указывает местонахождение фермента. Через
несколько дней окраска полос бледнеет, но вновь восстанавливается при погружении гелей в свежеприготовленный раствор KI—I*.
Для обнаружения ДНК-зависимой ДНК-полимеразы описаны два принципиально разных метода: один из них основан на реакции связывания, а второй — на полимеризации [916, 917]. В первом случае используют два идентичных микрогеля. На один микрогель наносят только фермент, а на другой — фермент, затравку ,[ДНК или поли-с1(А-Т)], субстраты (dATP и dTTP) и Mg2+. После электрофореза оба геля окрашивают амидовым черным. Белки, обладающие ферментативной активностью, образуют с затравкой комплекс, который из-за слишком большой молекулярной массы не может двигаться в геле во время электрофореза. Сравнивая эти два геля, можно обнаружить местонахождение фермента. Во втором методе к гелям перед полимеризацией добавляют затравку и затем проводят электрофорез. После электрофореза гели инкубируют при 37 °С в фосфатном буфере, содержавшем dATP, dTTP и Mg2+. Через разные интервалы времени гели помещают в 1%-ный раствор пиронина в 7,5%-ной уксусной кислоте и после окрашивания промывают 7,5%-ной уксусной кислотой. Новообразованный поли-ё(А-Т) выявляется в виде ярко-красных полос.
Метод, основанный на полимеризации, был также использован для обнаружения РНК-зависимой PHК-репликазы после электрофореза в микрогелях [920].
ДНК-зависимую PHК-полимеразу можно обнаружить любым из двух указанных методов, используя соответствующие затравку и субстрат [914, 919, 915].
Для выявления ДНК- и РНК-полимераз, разделенных на пластинках акриламидно-агарозного геля, применяют метод индикаторного геля [1328]. Раствор реагентов для определения РНК-полимеразы содержит 10 мМ К-малеатный буфер (pH 7,5), 8 мМ МпС12, 8 мМ p-меркаптоэтанол, ATP, GTP, СТР, UTP (каждый в концентрации 0,8 мМ), 1 мкКи 14С-АТР и 200мкг/мл ДНК. Раствор реагентов для локализации ДНК-полимеразы содержит 140 мМ буфер трис-НС1 (pH 7,4), 6 мМ MgCl2, 2 мМ Р-меркаптоэтанол, dATP, dGTP, dCTP и dTTP (каждый в концентрации 0,06 мМ), 0,4 мкКи/мл 14C-dCTP и 400 мкг/мл ДНК. Раствор реагентов смешивают с равным объемом 2,4%-ной агарозы, расплавленной при 42 °С, и формируют слой геля толщиной 1 мм. После электрофореза гели промывают тем же буфером, который используют для приготовления индикаторного геля. Затем на электрофореграмму кладут индикаторный гель, покрывают «сэндвич» пластмассовой пленкой и инкубируют примерно 2 ч при 37 °С. После инкубации индикаторный гель промывают 2—3 раза 2%-ным водным раствором стрептомицина.
