Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Таким образом, на 16-й нед беременности клеточная популяция амниотической жидкости состоит главным образом из слущенных клеток эктодермального происхождения: из эпителия амниона, эпидермиса кожи, а также эпителия потовых и сальных желез, ротовой полости и частично пищеварительного тракта и моче-поло-вых путей. Так как на ранних стадиях развития зародыш заглатывает амниотическую жидкость, то теоретически при амниоцентезе в пробу могут попадать слущиваюшиеся эпителиальные клетки энтодермально-го происхождения из гортани, пищевода, желудка, тонкого кишечника и трахеи. Число клеток в пробе амниотической жидкости широко варьирует не только на разных сроках беременности, но даже в разных пробах, взятых у пациента в одно и то же время. Ясно, что многое зависит от распределения отслоившихся клеток в момент взятия пробы. Вотта и др. [6] на 28—37-й нед беременности обнаружили 400—2800 клеток в 1 мл, в среднем 833,9, а в конце беременности (37— 40-я нед) — в среднем 2721 клеток в I мл. Вальштрём и др. [2], используя трипановый синий для определения жизнеспособных клеток в клеточных суспензиях, обнаружили, что число живых клеток в 1 мл амниотической жидкости на 16-й нед беременности составляет в 4 различных случаях 1940, 3720, 4500 и 5600 (среднее 3955). Это означает, что в 10 ,мл пробы, взятой в указанный период, содержится около 20 000—50 000 живых клеток, но, поскольку в клеточных культурах из амниотической жидкости наблюдается всего лишь несколько фокусов роста, :по-видимому, лишь небольшая часть клеток обладает способностью к росту.
ТИПЫ КЛЕТОК, ОБНАРУЖЕННЫЕ В АМНИОТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ НА 16-й НЕДЕЛЕ БЕРЕМЕННОСТИ
Клетки амниона
Несколько уплощенные кубовидные до 25 мкм в диаметре клетки с больши-м пузыревидным ядром и плотной эозинофильной цитоплазмой, часто вакуолизированной;
амниотические клетки иногда образуют шарики или гроздья, вероятно, вследствие скручивания слущснного слоя клеток, выстилающих амнион.
Клетки плоского эпителия из эпидермиса плода
Крупные поверхностные клетки 25—80 мкм в диаметре с обильной эозинофильной или цианофильной цитоплазмой. Ядро округлое, часто пикнотическое. Основную массу плоских клеток, отслаивающихся в амниотическую жидкость, «составляют безъядерные клетки или клетки с «тенями» ядер.
Группы недифференцированных клеток
В большинстве проб амниотической жидкости содержатся небольшие группы малодифференцированных клеток неизвестного происхождения. Размеры таких групп варьируют от 25 до 30 мкм. Каждая группа состоит из плотно упакованных клеток менее 10 мкм в диаметре со скудной цитоплазмой и округлым бледно-окрашивающимся ядром. Вероятнее всего, источником этих клеток служит энтодермальный эпителий дыхательного пути, пищеварительного тракта или моче-половых путей. По-видимому, именно эти клетки способны размножаться и давать начало эпителиоидному росту в первичных культурах.
Фагоцитирующие клетки
В большинстве проб встречается небольшое число мелких фагоцитирующих клеток, напоминающих макрофаги или гистиоциты. Судя по окрашенным мазкам, можно сказать, что они жизнеспособны, активно фагоцитируют и часто содержат в цитоплазме большую вакуоль. Эти клетки являются либо материнскими по происхождению, либо происходят из мезенхимы зародыша.
Эритроциты и лейкоциты
Наличие в некоторых пробах небольшого числа эритроцитов и иногда лейкоцитов обусловлено, по-видимому, попаданием материнской крови во время ампиоцентеза.
МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
В 1956 г. [8] появилось сообщение об определении «хромосомного» пола плода на основании исследования полового хроматина в клетках амниотической жидкости. Только в 1963 г. Фукс и Филип [9] получили культуру клеток амниотической жидкости, однако в своей работе они не приводили никаких данных относительно техники культивирования. Впоследствии было создано много разнообразных методик [10—16], причем в последних наиболее совершенных методиках удалось значительно сократить время, необходимое для получения достаточного количества клеток с целью изучения хромосом, а также увеличить выход успешных культур. Во всех этих методах среда для культивирования в основном сходна — основная среда определенного состава, такая, как среда Игла, 199 или Хэма F-10 с добавлением 15—30% бычьей эмбриональной сыворотки. Клетки культивируют в атмосфере, содержащей 5% СОг. Исключение составляет метод Сантессона [13] , в котором вместо бычьей эмбриональной сыворотки используют 20% человеческой сыворотки (от нескольких доноров) и 5% бычьего эмбрионального экстракта.
Бычий эмбриональный экстракт и бычья эмбриональная сыворотка, по-видимому, содержат важный ро-стовый фактор (ы), способствующий(ие) росту эпите-лиоподобных клеточных культур, при условии, что в пробе амниотической жидкости находится достаточно живых клеток, способных к делению. Мы не знаем, какова должна быть плотность эмбриональных клеток, необходимая для инициации культуры, но наиболее быстро клетки растут в том случае, когда клеточную популяцию из пробы амниотической жидкости концентрируют в 1 или 2 сосудах, имеющих небольшую поверхность, к которой могут прикрепиться клетки. Для этой цели подходят стандартные пробирки Лейтона или флаконы Карреля. Что касается времени образования монослоя, то в этом отношении клетки зародыша не отличаются от большинства других клеток; иными словами, скорость образования ими монослоя зависит главным образом от их плотности на единицу площади флакона
