Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ НА ПОКРОВНЫХ СТЕКЛАХ
Для посева на покровные стекла клетки можно брать на 1—4-й день инкубации. Почти все клетки: RK-13 клетки эмбриональных легких человека, почки обезьян, HeLa, НЕр-2 — хорошо растут на стеклах; исключение составляют GOR, ЕВз и различные линии лимфобластов, которые растут в суспензии и не прикрепляются к стеклу, Составы ростовых и поддерживающих сред для указанных выше .клеточных линий приведены в гл. 1.
Преимущество способа «летающих» покровных стекол для выращивания монослоя заключается в том, что перед внесением вируса и фиксацией все клеточные культуры можно просмотреть с помощью микроскопа и для окрашивания флуоресцирующими красителями выбрать только те культуры, которые находятся в хорошем состоянии.
Клетки можно выращивать на покровных стеклах, помещенных в чашки Петри. Чашки Петри с инокулиро-ванными клетками ставят в термостат при 37 °С. Атмосферу насыщают 5% С02. Среду в чашках Петри меняют с помощью пастеровской пипетки.
Другой метод выращивания клеток на покровных стеклах состоит в следующем. Клетки осторожно соскабливают с краев сосуда, в котором их выращивали, и суспендируют в солевом фосфатном буфере. Небольшое количество суспензии помещают на покровное стек-
ло и высушивают. После испарения буфера на покровном стекле остается слой клеток, который можно зафиксировать, погрузив стекло в ацетон. Аналогичным способом получают препараты инфицированных клеток. Однако неприкрепленные клетки имеют тенденцию округляться, поэтому их морфология видна не так отчетливо, как при выращивании непосредственно на покровных стеклах.
КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК НА ПРЕДМЕТНЫХ СТЕКЛАХ
Для получения монослоя используют также и предметные стекла. Приведем наиболее подходящий для этого метод [12]. К предметному стеклу с помощью нагретой смеси, состоящей из равных объемов парафина и вазелина, приклеивают стеклянные кольца. Застывший парафин обеспечивает плотный и водонепроницаемый контакт со стеклом. На одно стекло одновременно можно прикрепить до 6 колец. Внутрь каждого кольца помещают приблизительно 0,5 мл суспензии, содержащей 5-104—7-104 клеток. Для приготовления суспензии используют ростовую среду. Предметные стекла кладут в чашку Петри и инкубируют при 37 °С в термостате, поддерживая определенную влажность. Атмосферу насыщают 5% С02. Клеточный монослой формируется внутри кольца. Смену среды, внесение вируса и т. д. осуществляют с помощью тонкой пипетки. Перед фиксацией кольца снимают пинцетом, а отпечаток их в парафине служит границей участка, где образовался клеточный монослой.
ЗАРАЖЕНИЕ ВИРУСОМ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР НА ПОКРОВНЫХ СТЕКЛАХ
Клетки, выросшие на покровных стеклах, инфицируют следующим образом. Перед тем как добавить вирус, пробирки просматривают с помощью микроскопа, чтобы убедиться в хорошем состоянии клеток. Затем покровные стекла переносят в стерильную пробирку, соблюдая правила асептики. Это делается для того, чтобы клетки, выросшие на стенках пробирок, не заражались виру-
jm и не конкурировали за питательные вещества с ...летками, растущими на покровном стекле. В пробирки с 'сопенесенными стеклами добавляют по 1,6 мл поддерживающей среды и 0,4 мл суспензии вируса. Штатив с пробирками встряхивают на механическом шеикере в течение 1—2 ч при комнатной температуре. Осторожное перемешивание обеспечивает контакт вируса с клетками. Существует и другой способ заражения культур. В этом случае покровные стекла кладут в стерильные чашки Петри. В небольшою чашку Петри обычно помещается 4 покровных стекла. Необходимо внимательно следить за тем, чтобы стекла лежали вверх той стороной, ма которой растут клетки. На каждое покровное стекло добавляют по 0,4 мл суспензии вируса и оставляют на
1—2 ч при комнатной температуре. После этого покровные стекла помещают по одному в новые стерильные пробирки, в которые добавляют по 2 мл поддерживающей среды. Клетки сохраняются в хорошем состоянии при смене среды каждые 2 дня.
ФИКСАЦИЯ
Бмявить локализацию вирусного антигена в клетке чрезвычайно важно, поскольку очень часто эта локализация характеризует вирус. Ниже приведен метод, при котором сохраняется морфология клеток и местоположение антигена in situ. Этот метод пригоден для клеточного монослоя и тонких срезов органов.
Для выявления вирусных антигенов предметные или покровные стекла с выросшими на них клетками погружают на 10 мин в ацетон или этиловый спирт при комнатной температуре или при +4°С, после чего ацетон меняют и культуры хранят в ацетоне при —20 °С. Существует и другой метод. Препараты обрабатывают ацетоном при +4 "С, а затем помещают на 30 мин в смесь этилового спирта (95%) и сухого льда при температуре —70 °С. После этого ацетон удаляют, а покровные стекла вынимают из пробирок, высушивают на воздухе и хранят при комнатной температуре. Стекла, обработанные таким способом, хорошо сохраняются в течение
2 лет. Каждую исследуемую систему следует .предвари-
тельно тестировать с тем, чтобы подобрать такие условия, в которых будут получаться оптимальные результаты.
