Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
АДСОРБЦИЯ
Порошок из высушенной замораживанием печени дважды промывают стерильной дистиллированной водой и один раз — фосфатным буфером с pH 7,4. После каждой промывки суспензию центрифугируют. Промытый порошок добавляют к конъюгату из расчета 1 ч. промытого порошка на 5 ч. конъюгата и адсорбируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Смесь перемешивают, но так, чтобы не образовывались пузырьки воздуха. (Можно, пользоваться механической мешалкой, включая ее на небольших скоростях, или осторожно перемешивать смесь палочкой каждые 5 мин.) Полученную -суспензию центрифугируют в течение 30 мин (1000 об/мин) при +4°С. Конъюгат осторожно удаляют и вновь адсорбируют в течение 1 ч новой порцией промытого порошка, после чего опять центрифугируют. Чистую надосадочную жидкость с помощью пипетки разливают в аликвотных количествах по ампулам; ампулщ закупоривают и хранят при —20 °С.
ОКРАШИВАНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМИ АНТИТЕЛАМИ СЫВОРОТКИ
Очень часто при получении антисыворотки против вируса, выращенного на клеточной культуре, образуются антитела не только против этого вируса, но и против клеточного материала, который вводится вместе с вирусом. Например, если антасыворотка против RSV получена на кроликах и при добавлении антикроличьего конъюгата к незараженным клеткам HeLa или НЕр-2 наблюдают флуоресценцию, то необходимо избавиться от этого неспецифического окрашивания, искажающего результаты. Весьма эффективна в этом случае адсорбция сыворотки тканями, используемыми в исследуемой системе. Метод, дающий хорошие результаты, описан Сандером [13].
Адсорбция сыворотки нормальной тканью
Один миллилитр антисыворотки истощают клетками HeLa или НЕр-2, полученными из заросших матрасов Рауса. Смесь клеток с антисывороткой встряхивают механическим способом в течение 90 мин при 37 °С, а затем помещают на 18 ч (на ночь) при 4°С. Клетки удаляют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин при +4Х. Для того чтобы определить, удалены ли яеспецифические факторы, истощенную сыворотку - тестируют против незараженных клеток HeLa и НЕр-2.
Определение оптимального рабочего разведения конъюгата и сыворотки
Для того чтобы получить сильную флуоресценцию на минимально окрашенном фоне, необходимо определить оптимальные разведения конъюгата и сыворотки. Для этого разведения сыворотки титруют против разведений конъюгата в присутствии известного антигена в определенной клеточной системе. Если титр обоих компонентов довольно высок, то адсорбция не обязательна, поскольку при используемых разведениях неспецифиче-ский эффект может не проявиться.
Снижение неспецифического окрашивания, обусловленного другими факторами
Неспецифическое окрашивание можно уменьшить, соблюдая следующие правила:
]. Брать кровь у больных следует натощак, что уменьшает содержание жировых веществ в сыворотке.
2. Хранить материал при рекомендуемых температурах. Конъюгат и сыворотка должны храниться в небольших аликвотах при —20°С. Стараться не допускать излишних повторных замораживаний и оттаиваний.
3. Всю стеклянную посуду необходимо тщательно мыть. Она должна быть изготовлена из нефлуоресцирующего стекла. Резиновые пробки не должны быть токсичными; желательно использовать пробки из белой или силиконовой резины.
4. Следует пользоваться реактивами квалификации «чистый для анализа» (ч.д.а.). pH фосфатного буфера необходимо довести до 7,2—7,6. Лучше пользоваться реактивами, очищенными биологически, чем на колонках с сефадексом или ДЭАЭ.
5. Если антиген получают в культуре ткани, то лучше брать :культуры на самых ранних стадиях заражения вирусом, т. е. сразу после эклиптической фазы размножения вируса. При увеличении цитопатического действия вируса присутствие погибших клеток способствует неспецифическому окрашиванию.
Культуры клеток на покровных стеклах
Однослойные культуры можно выращивать на покровных стеклах разными способами: 1) на «летающих» покровных стеклах; 2) в чашках Петри; 3) в вертикально стоящих пробирках на круглых покровных стеклах.
Покровные стекла, предназначенные для выращивания клеток, кипятят 20 мин в слабом растворе детергента (Pyroneg), затем споласкивают 3 раза дистиллированной водой и 3 раза деионизованной водой, 96%-ным спиртом, 99%-ным спиртом и ацетоном (ч. д. а.). Покровные стекла ставят вокруг края чашки на куске фильтровальной бумаги и высушивают. Высушенные
стекла помещают в пробирки размером 100X12 мм, которые ставят в штатив, покрытый алюминиевой фольгой, и стерилизуют сухим жаром.
Пробирки засевают клетками в такой концентрации, которая обеспечит образование монослоя, и плотно закрывают резиновыми пробками. Штатив ставят в термостат наклонно под углом 3° к горизонтали и инкубируют до образования сплошного клеточного слоя. Очень важно, особенно при окрашивании клеток, знать, на какую сторону покровного стекла прикрепились клетки. Для этой цели можно маркировать стекла, обрезая один из углов. В пробирках такие покровные стекла ориентируют одинаково по отрезанному краю.
