Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
/ — первичный фильтр,
тового и ультрафиолетового облучения, а также для гарантии безопасности в случае взрыва лампа полностью закрыта. Срок службы лампы составляет около 200 ч, но ее эффективность заметно снижается уже через 150 ч. Время, в течение которого работает ламт, следует записывать, причем на каждое включение и выключение обычно добавляют 2 ч. Пускорегулирующее устройство обеспечивает высокое напряжение, необходимое для образования дуги. Собирательные линзы, находящжся внутри лампы,-как правило, фиксируют в определенном положении на заводе. За ними следует теплопоглощающий фильтр, положение которого также фиксировано. При установке новой лампы ее необходимо центрировать. Для этого на выходную апертуру в основании микроскопа помещают листок тонкой бумаги. Слегка закрыв диафрагму микроскопа, лампу располагают таким образом, чтобы изображение дуги между двумя электродами находилось в центре выходной апертуры.
Спектр нспускания лампы НВО 200 лежит в пределах 280—600 нм с главными пиками при 365 и 435 нм (рис, 8.2), При работе с ультрафиолетовым светом и темнопольным конденсором длина волны возбуждающе-
Рис. 8.3. Спектры поглощения (/) и испускания (II).
Рис. 8.4, Взаимоотношения между различными частями микроскопа, длиной волны, поглощением и испусканием.
/*- ртутная лампа НВО 200: 2 — первичный фильтр (поглощает лиднмыА свет и тепло); —объект (ФИТЦ поглощает свет н испускает с&ет с большей длиной волны); 4 —вторичный фильтр (поглощает УФ-свет до 385 км); 5 — глаз.
го света для ФИТЦ лежит в пределах между 290 и 400 нм (рис, 8.3). Зеленое свечение ФИТЦ лучше всего видно на фоне голубой аутофлуоресценции ткани. Это достигается с помощью расположенного над объектом вторичного фильтра, который поглощает свет с длиной волны до 385 нм. Темнопольный конденсор особенно нужен при микроскопировании с масляной иммерсией, ПОскрльку он уменьшает «цветение» масла за счет
уменьшения освещенного пространства. Такой конденсор, кроме того, рассеивает свет, тем самым направляя его в сторону от объектива, в результате чего большая часть спектра первичного 'источника используется для стимуляции флуоресценции; темное поле может быть также создано относительно тонким барьерным фильтром. Для того чтобы проходили только одни ультрафиолетовые лучи и поглощались видимые и тепловые, следует пользоваться первичным фильтром. Таким образом, до объекта доходит свет с длиной волны только до 400 нм (рис. 8.4). Пики поглощения для ФИТЦ составляют 290, 325 и 495 нм, а пик излучения — 525 нм.
ФОТОГРАФИРОВАНИЕ
Фотографируют препараты с помощью камеры ЕХА IA. Для получения цветных диапозитивов используют пленку Kodak Ektachrome, тип В, которая дает удовлетворительные результаты при искусственном освещении. Время экспозиции зависит от интенсивности флуоресценции и составляет 2,5—3 мин. Для получения черно-белых негативов пользуются пленкой Kodak Tri-X. Время экспозиции также составляет 2,5—3 мин (рис. 8.5—8,9).
НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ОКРАШИВАНИЕ
Одно из самых важных требований, которые предъявляются к технике флуоресцирующих антител, заключается ¦в том, чтобы получить специфическое окрашивание комплекса антиген—антитело. Флуоресценция должна обнаруживаться только в том участке препарата, где произошла реакция антиген—антитело. Если окрашивание ткани обусловлено не этой реакцией, его называют неспецифическим. Такое окрашивание может быть обусловлено свободным флуоресцирующим красителем в конъюгате, конъюгированными белками сыворотки или какими-то другими неспецифическими конъюгированными антителами.
Свободный флуоресцирующий краситель можно удалить из конъюгата либо гель-фильтрациен на сефадексе,
Рис. 8.5. Флуоресцирующие клетки ЕВз.
Рис. 8.6. Клетки ЕВ3 (контроль).
Pihic. 8.7. Эмбриональное легкое человека.
Клеточная линия с хронической инфекцией*
Рис. 8.8. Эмбриональное легкое человека (контроль)
232 Ш. Хадсон
либо в полиакриламидном геле. При использовании готовых конъюгатов, поступающих в продажу, с этим обычно не сталкиваются, однако если конъюгаты неправильно хранят, то происходит их диссоциация.
Рис. 8.9. Клетки RK-13 через три дня после инфицирования вирусом
краснухи.
Видна флуоресценция цитоплазмы единичных клеток.
Окрашивание конъюгированными сывороточными белками, по мнению Нейрна [11], обусловлено электростатическими силами между препаратом и сывороточными белками. Такие белки ведут себя как кислые красители и окрашивают положительно заряженные белки тканей. Их можно удалить, адсорбируя сыворотку порошками ткани. Таким же способом можно обработать и флуоресцирующие конъюгаты.
Ниже описан метод, который применяется в лаборатории автора.
Применение метода флуоресцирующих антител 233
АДСОРБЦИЯ КОНЪЮГАТА ПОРОШКОМ ПЕЧЕНИ
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОРОШКА ПЕЧЕНИ
Печень только что забитых взрослых мышей (для забивки не следует применять анестезирующие вещества) измельчают ножницами. Примерно по 1 мл полученной кашицы помещают в стерильные пробирки. Пробирку накрывают небольшим кусочком марли и ткань замораживают, помещая пробирки в контейнер с замораживающей смесью, например с сухим льдом и спиртом. Содержимое пробирок затем высушивают замораживанием в течение 24 ч, после чего высушенную тань переносят в стерильную ступку и измельчают в порошок. Такой порошок хранят в пробирках, закрытых пробками, при +4°С. Очень хороший готовый препарат, приготовленный из свиной печени, можно получить от фирмы Wellcome Reagents Ltd.
