Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Препарат помещают на чистое предметное стекло, заключают 'и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа.
2. НЕПРЯМОЙ МЕТОД
Этот метод основан на 2 реакциях: сначала неконъюгировавшая иммунная сыворотка реагирует с антигенам; затем препарат тщательно отмывают от свободных антител, после чего добавляют конъюгированный «ан-тивидовой» белок, т. е. белок, специфичный в отношении вида — источника иммунной сыворотки. Реакция протекает 30—60 мин при 37 °С. После этого препараты обрабатывают так же, как по методу 1.
окрашивание комплементом
Эта техника не получила широкого применения. Голдвассер и Шепард [9] показали, что с ее помощью можно выявить антитела в таких разведениях, в которых они другими методами не 'выявляются. Используют антисыворотку из различных источников, содержащую комплемент морской свинки, и добавляют затем конъюгат против тканей морской свинки. Если используют антисыворотку не от морских свинок, то ее необходимо в течение получаса инактивировать лри 56 °С для того, чтобы избежать конкуренции между различными типами комплемента за связывание с комплексом антиген— антитело.
Этот метод дает возможность использовать конъюгат против морской свинки с сывороткой любого происхождения. Кроме того, чувствительность его возрастает, если сыворотку сначала инактивируют.
Преимущества и недостатки прямого и непрямого методов
Как можно видеть из рис. 8.1, прямой метод основан на одноступенчатой реакции, тогда как непрямой метод включает две ступени. Кроме того, прямой метод быст-
рее, поэтому использовать его в целях диагностики значительно удобнее. Процесс конъюгации сыворотки не сложен, но трудоемок. Преимущество непрямого метода состоит в том, что один конъюгат можно использовать для разных антигенов. Сейчас выпускаются готовые конъюгаты; качество таких конъюгатов бывает различ-
Ў
V
А
ступень
{
и
in ступень-----
2-я ступень------
V А
V
Phc. 8.1. Схема реакции при прямом (/1) и непрямом (Б) обнаружении антигенов с помощью иммукофлуоресценцни.
/—меченые v-глобулины; 2 — антиген; J — немеченое антитело; 4 — антиген
и антитело; 5 — меченый комплекс антиген -
ным. Поэтому, чтобы определить пригодность конъюгата, каждую его партию следует проверять в условиях выбранной системы.
Непрямой метод, как правило, более чувствителен. Его можно рассматривать как двойную реакцию антиген—антитело, в которой продукт первой реакции становится антигеном для второй.
ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ СОЕДИНЕНИЯ
Флуоресцирующим называют такое соединение, которое поглощает свет одной длины волны, переходит в возбужденное состояние и испускает свет другой длины волны. Из-за потери энергии испускаемый свет всегда
характеризуется большей длиной волны, чем возбуждающий, и, таким образом, не зависит от длины волны поглощенного света. Флуоресдеин испускает свет в желто-зеленой области спектра независимо от того, облучен ли он ультрафиолетовым или синим светом.
Для флуоресцентной микроскопии наиболее широко и^лользуют такие красители, как лизамин родамин В {RB 200), Дане (1-днметиламино-нафтален,5-сульфоно-вая кислота) и флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ). Последний из них заменил собой флуоресцеинизоцианат, первоначально использованный Кунсом, поскольку тио-цианат химически более стабилен. Мы не будем здесь подробно рассматривать метод получения конъюгатов; это не входит в нашу задачу. Описание методики приготовления меченых сывороток можно найти в работе Нпйрна [10].
Вещество, которое используется как конъюгат, должно быть стабильным. Его стабильность зависит от многих факторов, например от pH среды или от температуры. \ак правило, чем выше температура, тем менее стабилен конъюгат. В запаянных ампулах при —20 °С конъюгаты сохраняют активность в течение нескольких месяцев. (Некоторые конъюгаты рекомендуют хранить при + 4 °С.) Очень важно, чтобы после конъюгации активность антител в сыворотке не менялась и не снижаюсь флуоресцирующие свойства красителя. Цвет флуо-зецирующего конъюгата должен отличаться от фона /кани.
Все предметы для микроскопирования должны содержаться в чистоте, поскольку накапливающаяся пыль может влиять на специфическую флуоресценцию. Ис-'.юльзуют предметные стекла толщиной 1 мм, изготовленные из нефлуоресцирующего стекла. Иммерсионное масло, которое также не должно флуоресцировать, луч-пе держать в маленьком флакончике, а не в большом пузырьке, в который при частом открывании крышки попадает пыль. Для заключения препаратов используют нефлуоресцирующие среды. Полупостоянные препараты можно заключать в фосфатный глицериновый буфер pH 7,0—7,4; в «DPX» или Polafluer заключают постоянные препараты.
Объект, над которым помещают фильтр, поглощающий ультрафиолет и тем самым защищающий глаза наблюдателя от действия вредных лучей, облучают сильным источником длинноволнового ультрафиолетового света, например ртутной лампой с высоким давлением, такой, как НЕЮ мощностью 200 Вт. Для защиты от све-
Рис. 8.2. Спектр испускания ртутной лампы НВО 200.
