Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
щается много вещества, то либо оно, либо продукты его расщепления накапливаются в клетке, в результате чего последняя сильно увеличивается. Механизмы фагоцитоза и переваривания у макрофагов подробно исследованы с помощью электронного микроскопа; соответствующее описание можно найти в монографиях по структуре клеток, например у Тонера и Карра [16].
ИСТОЧНИКИ ПОЛУЧЕНИЯ МАКРОФАГОВ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Из сказанного ясно, что источником макрофагов могут служить многие ткани животных. Действительно, эти клетки всегда можно обнаружить на ранних этапах культивирования кусочков разных тканей, взятых у разных животных. В чистой культуре их (впервые выделили в 1921 г. Каррел и Эбелинг [17] путем эксплуатации рыхлого поверхностного слоя (buffy coat) осадка, полученного при центрифугировании крови курицы. В качестве питательной среды авторы использовали гомологичную плазму, содержащую экстракт тканей эмбриона. Это удалось не только благодаря тщательности эксперимента, но и потому, что крупные одноядерные лейкоциты (макрофаги) крови птиц в отличие от других типов птичьих лейкоцитов способны к размножению и длительному существованию в искусственной среде. Это дало возможность в результате последовательных пересевов освободить культуру от примеси других клеток. Каррел и Эбелинг поддерживали культуру макрофагов в хорошем состоянии в течение 3 мес. Они исследовали их морфологию, способность к амебоидному движению и фагоцитозу, а также их реакции на изменения состава культуральной среды.
Поскольку многие работы, выполненные на макрофагах, имеют отношение к проблемам физиологии и патологии человека, желательно проводить такие исследования на культурах макрофагов человека или по крайней мере на макрофагах млекопитающих. Попытки выполнить это требование^ сразу же наталкиваются на трудности, связанные с тем, что, хотя макрофаги млекопитающих сохраняют жизнеспособность в искусствен-
ной среде, заставить их размножаться в этих условиях до сих пор не удавалось (имеется 1—2) сомнительных исключения). Вероятно, это обусловлено не методикой культивирования, а тем, что и in vivo нормальные дифференцированные макрофаги не способны к размножению. Какова бы ни была истинная причина этого явления, оно стимулировало поиски таких источников макрофагов, из которых можно было бы получить достаточно макрофагов при минимальном числе клеток других типов без риска загрязнения культуры микроорганизмами.
Оказалось, что среди доступных для анализа наиболее пригодны клетки следующих млекопитающих (расположены в порядке убывания): мыши, кролика, человека, морской свинки, крысы. Найти ткань, практически пригодную в качестве источника макрофагов, не так легко. В ряде тканей содержится мало макрофагов — достаточно серьезный недостаток, поскольку в культуре эти клетки не размножаются. В материале из некоторых тканей неизбежна примесь других клеток; порой это не столь важно, иногда же для освобождения от этих клеток приходится прибегать к весьма сложным приемам. Ткань иногда так неудачно расположена, что для получения «чистого» материала, свободного от микроорганизмов, приходится изыскивать особые методы.
Для иллюстрации сказанного рассмотрим кратко те «за» и «против», которые приходится учитывать при выборе того или иного из используемых обычно источников, включая те, которые обеспечивают приемлемый компромисс и которые подробно описаны ниже.
Доступным источником макрофагов может служить цельная кровь. Ее легко взять с соблюдением правил асептики, однако методика отделения макрофагов (моноцитов) от других клеток сложна и выход макрофагов довольно мал. Много макрофагов содержится в кроветворной ткани костного мозга, однако, как и при использовании в качестве источника других солидных тканей, получить из ткани костного мозга однослойную культуру клеток можно лишь за счет миграции их из эксплантатов; поэтому в таких культурах неизбежна примесь фибробластов, которые, размножаясь, постепенно вытесняют макрофаги.
Перитонеальные транссудаты большинства млекопитающих содержат макрофаги. Особенно много этих клеток в транссудатах у мыши и морской свинки, однако наряду с макрофагами там присутствуют самые разнообразные их предшественники, а также лимфоциты, эозинофильные полиморфноядерные лейкоциты и тучные клетки. Перитонеальный транссудат — это наиболее широко используемый источник макрофагов, поскольку его можно получить путем вымывания, соблюдая асептические условия, а от примеси посторонних клеток легко освободиться. Между мышами и морскими свинками в этом отношении нет различий, но, так как мыши дешевле, обычно пользуются ими.
В качестве практической рекомендации для увеличения содержания макрофагов в перитонеальной жидкости можно предложить внутрибрюшинную инъекцию чужеродных веществ обычно за несколько дней до вымывания жидкости. Используются разные вещества: при работе на мышах —крахмал [18], казеинат натрия [19] и тиогликолатная среда Difco[20]; в опытах на морских свинках — гликоген [21]. Подобное воздействие применяется и на других животных, например на кроликах— гликоген [22], легкое или тяжелое минеральное масло [23, 24] и жидкий парафин [25]; на крысах — гликоген печени кролика [26], бульон из бычьего сердца с добавлением протеозного пептона Difco [23] и про-теозный пептон [27]. Подобное воздействие значительно увеличивает выход макрофагов, особенно при использовании тех животных, у которых в норме перитонеальный транссудат не очень богат этими клетками. Не известно, однако, будут ли макрофаги, полученные после такого воздействия in vivo, нормально реагировать на разнообразные агенты в культуре. Кроме того, существует приводимый ниже метод получения высокого выхода перитонеальных макрофагов мышей и без применения дополнительных воздействий.
