Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Многие считают, что дешевле и удобнее получать вирусные антигены самим. Реагенты для использования в реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации и нейтрализации можно получить, используя обычные культуры.. В реакции нейтрализации антигеном служит живой вирус с высоким титром —
100 и 10000 X—используемого разведения, хотя в некоторых случаях легче посоветовать, чем добиться этого. Чем больше число инфекционных частиц на единицу объема антигена, тем лучше будут результаты. Антиген с высоким титром можно использовать дольше, чем антиген с низким титром, и получаемые при этом данные более однородны. Живые антигены лучше хранить при —70 °С в аликвотах, каждая из которых используется один раз, а затем выбрасывается.
Вирусные антигены для реакции связывания комплемента получают путем заражения культур тканей соответствующими вирусами, например вирусом герпеса или полиомиелита, респираторным синцитиальным вирусом или группой аденовирусов. Антигены группы миксовирусов лучше получать, используя для этого оплодотворенные яйца. Комплемент-связывающий антиген вируса краснухи был впервые получен в 1964 г. Севером и др. [21]. Подобные антигены можно приготовить при инокуляции культуры клеток ВНК 21 быстро размножающимся вирусом. На 5—6-й день после посева клетки собирают и обрабатывают глициновым буфером не менее 6 ч при pH 9. Линия ВНК 21 представляет собой быстро размножающиеся фибробласты. Очень быстро эти клетки можно получить в большом количестве и хранить в замороженном состоянии, пока они не потребуются. Многие антигены, связывающие комплемент, которые получают путем заражения культур клеток, лучше хранить в лиоф'илизированном состоянии.
Антигены для реакции торможения гемагглютинации редко получают с использованием культур тканей, поскольку в других системах титр образующихся гемаг-глютининов более высок. Можно приготовить антигены миксовирусов, аденовирусов, вирусов оспы и некоторых представителей энтеровирусов. Однако гемагглютинино-вые титры, специфичные в отношении этих антигенов, могут оказаться недостаточно высокими для использования культуры клеток в практических целях. Вполне удовлетворительный титр можно получить для некоторых представителей группы ECHO.
Применение теста на гемагглютинацию вируса краснухи [22] значительно упростило лабораторную диаг-
ностику. Первоначально для выявления вируса краснухи применяли реакцию нейтрализации с использованием в качестве индикатора торможение интерференции в культуре клеток обезьяньей почки. Позднее стали применять метод торможения цитопатического эффекта на перевиваемой линии клеток кроличьей почки (RK-13) [23]. Оба эти метода трудоемки. Обнаружение комплемент-связывающего антигена и гемагглютинина значительно упростило определение антител к вирусу краснухи. Титр антител, выявляемых в реакции торможения гемагглю-тинации, резко возрастает в течение недели после появления сыпи. Таким образом, период времени, необходимый для установления диагноза краснухи, сократился с 14 до 7 дней после появления сыпи.
Соответствующий антиген получают в культуре клеток ВНК 21. Культуры инокулируют вирусом с высоким титром и клетки инкубируют пять дней. На 3-й и 4-й день среду меняют, а старую среду соединяют со средой, которую сливают с клеток на 5-й день. Такую среду обрабатывают эфиром и твином 80 и определяют ее активность. Клетки можно использовать для получения комплемент-связывающего антигена методом глициновой экстракции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В этой главе автор в общих чертах наметил границы применения метода культуры тканей в диагностической вирусологии. Разумеется, в одну главу невозможно в,местить огромное количество накопленных по этому вопросу знаний. Читатель, специально интересующийся этой областью исследования, может воспользоваться основными руководствами, список которых приведен в конце главы.
Сейчас основные усилия вирусологов направлены на поиски эффективных противовирусных препаратов. Несколько таких препаратов уже появилось, однако применение их пока ограничено. Значение диагностических вирусологических лабораторий возрастает по мере создания новых антивирусных препаратов. Кроме того, необходимы поиски новых методов выделения и идентификации вирусов. В настоящее время наиболее перс-
пективными представляются иммунофлуоресценция и электронная микроскопия. До тех пор пока не будут найдены другие методы выделения и идентификации вирусов, тканевые культуры останутся основой всех работ в этой области.
ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
L Enders /. F. et al., Science, N. Y., 109, 85 (1949).
2. Dalldorf G., Science, N. Y., 110, 594 (1949).
3. Meltiick J. L., Shaw E. W., Curtien E. C., Proc. Soc. exp. Biol. Med., 71, 344 (1949).
4. Robbins F. C., Enders J. F., Weller Т. HFlorentino G. LAm.
J. Hyg., 54, 286 (1951).
5. Rowe W. P., Huebner R. Gilmore L. K, Parrot R. H., Ward T. G., Proc. Soc. exp. Biol. Med., 84, 570 (1953).
6. Hilleman M. RWerner J. H., Proc. Soc. exp. Biol. Med., 85, 183 (1954).
