Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
В выбранные культуры добавляют по 0,2 мл пробы. Опыт ставится по крайней мере на двух типах культур, причем используют не менее двух пробирок для каждого типа. Контролем служат незараженные культуры. Использовать для инокуляции только один тип клеток неразумно, поскольку нет никакой гарантии в том, что поведение некоего специфического вируса будет соответствовать ожидаемому. Нет также и гарантии в том, что будет выделен вирус, указанный клиническим диагнозом. Кроме того, инокуляция нескольких типов клеточных культур помогает при дифференцировке вирусов.
Инокулированные культуры последуют микроскопически ежедневно в течение 14 дней. Отмечают изменения, наблюдающиеся в культурах, и, насколько возможно, определяют причину этих изменений.
Многие широко распространенные вирусы вызывают цитопатические эффекты, которые уже хорошо описаны. Яркий пример такого эффекта показан на фиг. 4.3. Некоторые вирусы, однако, такой эффект вызывают гораздо позже, чем, например, феномен гемадсорбции или
Рис. 4.3.
А. Нормальная культура клеток из легких эмбриона человека. Б. Вирус герпеса простого в клетках из легких эмбриона человека.
интерференции. И наконец, есть вирусы, вовсе не вызывающие цитопатического эффекта, и их можно обнаружить только косвенными методами. Попытки изолировать эти вирусы требуют использования большего числа культур, чем обычно, так как через определенные промежутки времени часть культур изымается для анализа.
Представители группы миксовирусов, за исключением RSV, вызывают гемадсорбцию. Реакцию гемадсорб-ции ставят следующим образом. Инокулированные культуры и неинокулированные контрольные культуры промывают холодным солевым раствором и в каждую пробирку добавляют 0,5—1,0% (по объему) суспензии эритроцитов морской свинки. После 30 мин инкубации на холоду культуры еще раз промывают холодным солевым раствором, чтобы удалить свободные эритроциты, и исследуют на присутствие эритроцитов, прикрепленных к клеточному пласту. Когда выделяют миксови-русы, необходимо инокулировать достаточно большое количество культур, потому что в течение 21 дня каждые 3 дня берут по одной пробирке для анализа и, кроме того, оставляют некоторый запас культур для идентификации вируса, если он будет обнаружен.
Техника интерференции предложена одной из групп исследователей, которые впервые выделили вирус краснухи [13]. Культуры тканей инокулируют материалом, предположительно содержащим вирус краснухи. После определенного периода инкубации, составляющего обычно 10 дней, часть культур заражают другим вирусом, вызывающим быстрый цитопатический эффект. Интерференция обнаруживается по отсутствию цитопатиче-окого эффекта, в то время как в контрольных культурах наблюдается дегенерация клеток. Для обнаружения вируса краснухи используют вирусы ECHO, коксеки А9 и Синдбис. «Опознавательные» вирусы не обязательно должны быть родственны интерферирующему вирусу. Интерферирующие агенты можно определить с помощью модифицированной реакции нейтрализации.
Метод иммунофлуоресценции позволяет быстро обнаружить и определить вирусы в культурах тканей. Этот метод, очень важный для диагностики вирусной инфекции, не сложен и требует относительно простого оборудования. С помощью иммунофлуоресценции вирусы «идентифицируются значительно быстрее, чем с помощью обычных вирусологических методов. Эта методика подробно обсуждается в гл. 8.
Культуры тканей в сочетании с электронной микроскопией можно использовать для дифференцировки в*и-
русов, выделенных из клинического материала. Так, вирусы группы герпеса можно отличить от вирусов оспы по их морфологическим различиям. В будущем для определения вирусов, возможно, будут разработаны методы, сочетающие серологический тест с электронной микроскопией, хотя титрование вируса на ультраструктур-ном уровне имеет свои недостатки, обусловленные не только высокой стоимостью электронного микроскопа.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ТКАНЕВЫХ
КУЛЬТУРАХ
В тех случаях, когда в распоряжении исследователя имеются только пробы сыворотки здоровых и больных, для определения содержания антител в сыворотке используют культуры тканей. Антитела ко многим энтеровирусам, в том числе и к вирусам группы полиомиелита, нельзя обнаружить никаким другим методом. Метод нейтрализации и его многочисленные модификации основаны главным образом на смешивании сывороток различных разведений со стандартным количеством живого вируса. После соответствующего периода инкубации образцами полученных смесей заражают культуры тканей. Инфицированные культуры инкубируют снова и ежедневно исследуют для выявления цитопатического эффекта. Этот метод легко приспособить для исследования вирусов, обнаруженных косвенным путем. О присутствии антител судят по торможению цитопатического эффекта, обычно вызываемого этим вирусом. К числу модификаций этого теста следует отнести реакцию торможения гемадсорбции, метод бляшек и метод подавления обмена.
ОБРАЗОВАНИЕ АНТИГЕНА
