Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
поэтому можно проверить их пригодность, прежде чем заказывать большие количества.
Одной из наиболее ответственных стадий в приготовлении сред является стерилизация. Термостабильные среды стерилизуют автоклавированяем. Этот метод дешев и при соблюдении условий очень эффективен. В результате автоклавирования среда может несколько измениться, но эти изменения не всегда вызывают нежелательный эффект. По данным Сарджента и Смита [22], при совместном автоклавировании глюкозы и фосфатов образуется соединение, которое стимулирует рост и прикрепление эпителиальных клеток к стеклу. Было также обнаружено [23], что качества ростовой среды ухудшаются, если ее стерилизуют фильтрованием, а не ав-токлавированием. В том случае, когда среда состоит из лабильных компонентов (а к таким средам относится большинство сред полностью или частично химически определенного состава), эффективная стерилизация обычно достигается фильтрованием. Однако было показано [24], что среда Игла при включении в нее сукци-натного буфера становится термостабильной при pH 4—
4,5. Перед употреблением в автоклавированные среды нужно добавлять растворы глутамина и бикарбоната.
Большинство методов стерилизации фильтрованием имеет свои проблемы. Некоторое время широко применялись керамические свечи, но при этом отмечалось нарушение роста клеток, что, по-видимому, обусловлено либо избирательной адсорбцией компонентов из среды, либо каталитической активностью поверхности пор свечи. Недостатком фильтров Зейца является наличие в асбестовых прокладках токсических веществ, которые экстрагируются при прохождении среды [25]. Большинство исследователей наилучшим методом стерилизации считают фильтрование через мембранные фильтры, однако некоторые мембранные фильтры пропитывают детергентом, который способствует смачиванию и стерилизации, но может оказаться токсичным для клеток. Тем не менее и асбестовые прокладки, и мембранные фильтры можно предварительно промыть, удалив при этом токсичные вещества. Не следует пользоваться хромированными аппаратами, так как при про-
хождении кислых фильтратов из лежащих ниже слоев может высвобождаться медь, образуя токсичный продукт.
В настоящее время для обогащения питательных сред используются разнообразные сыворотки. Обычно их выпускают либо нативными, либо инактивированными нагреванием при 56 °С в течение 30 мин. Тепловая инактивация разрушает комплемент и некоторые случайно попавшие в среду вирусы, что очень облегчает проведение вирусологических исследований. Обработанная таким способом сыворотка, возможно, несколько снижает способность клеток к росту, но хорошо хранится при +4°С. Непрогретая сыворотка менее стабильна, и ее следует хранить при —20 °С. Замороженные среды и компоненты сред нужно хранить в специальных сосудах; эти сосуды не следует заполнять целиком, так как при замерзании жидкость расширяется.
Предприятия, выпускающие среды, проверяют их на способность обеспечивать рост и на токсичность. Однако единой методики проверки до сих пор еще не разработано. Сравнительно легко проверить среды, предназначенные для роста первичных культур. В этом случае используются клетки, чувствительные к качеству питательной среды; показателями служат их рост и морфология, причем особое внимание следует обращать на появление признаков токсического действия среды. Труднее испытывать пригодность среды для длительного культивирования клеток. Существуют две возможности: проверка эффективности клонирования и испытание в последовательных пересевах. Тест на относительную эффективность клонирования выявляет даже небольшие различия в качестве сред, но имеются данные [27] о том, что высокая эффективность клонирования на среде не обязательно коррелирует с ее способностью хорошо обеспечивать рост. В связи с этим возникают некоторые сомнения в ценности метода клонирования для определения пригодности среды. Испытание среды в последовательных пересевах занимает много времени, но, поскольку это испытание проводится в тех же условиях, в которых обычно используется среда, результаты его надежнее. Считается, что если среда способна поддер-
живать рост клеток по крайней мере в течение шести пересевов и лишь затем наблюдаются ограничения в числе пересевов, то эти ограничения обусловлены свойствами самих клеток, а не среды. Следовательно, чтобы убедиться в пригодности среды для продолжительного культивирования клеточных линий, ее необходимо проверить не менее чем в течение шести пересевов.
СБАЛАНСИРОВАННЫЕ СОЛЕВЫЕ РАСТВОРЫ
Все сбалансированные солевые растворы являются производными физиологического раствора, разработанного Рингером [28]. В состав раствора Рингера входят три катиона — кальций, калий и натрий — в таких же пропорциях, в каких они содержатся в морской воде или в крови высших животных. Первым сбалансированным солевым раствором, специально предназначенным для клеток млекопитающих, был раствор Тироде ’[29]. Недостаток этого раствора состоит в том, что при его приготовлении следует соблюдать особую осторожность, чтобы избежать выпадения в осадок кальция. С тех пор появился целый ряд рецептов приготовления сбалансированных солевых растворов. Ни один из них не имеет особых преимуществ для роста клеток: при разработке этих рецептов ставилась задача улучшить буферные свойства или не допустить образования осадка. В настоящее время наиболее широко используются растворы Эрла [30] и Хэнкса [31]. Раствор Эрла обладает свойствами сильного буфера благодаря высокой концентрации бикарбоната натрия. Раствор Хэнка составлен таким образом, что он уравновешивается воздухом, а не СОг. Этим раствором рекомендуют пользоваться в тех случаях, когда для клеток, которые культивируют, бикарбонат токсичен. Солевой фосфатный буфер Дульбек-ко и Фогта [32] употребляется для орошения и промывания клеток и как основа *для раствора трипсина. Составы упомянутых выше сбалансированных солевых растворов приведешь в таб-л. 1.1. Более подробные сведения о приготовлении солевых растворов и рецепты реже используемых растворов можно найти в обзоре Стьюарта и Кирка [33].
