Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
га о я о
U
О)
§
о
н
я
л
я га и н ^ У я я а <и^
о
р.
й э<\о &Йи а
s s
§1
O.S
<и
со Jj w>
П от СО ^
о.'й>3
иГЕ М
О е 'S
С J п
ира)
. Ео^ з-г •Сов
•- ° Z л 2
•РОК
со •’-
О.Г ^
о
+J О (и
>, о <и ОД ч
о&« •1—< с
и, !Г со
с; <^а
wi S
Ли >» Oj м
Й
W о § >>« К j §
со *5 R
к Sw
о 5 J2 и сЗ
2 « й со s о
« Ё к. 0,8 ^
3 си а) Э с
№ д-О О
>>s
§5-^5
I S’c s
I О л ^
I
go| aEg a ^ 3
•5b ^ H я ®
ь « ? S
V Bu >*
« 10^ s
„3 | й
о > ^ S
0 < S
te^CL &
5.2*
CU
Ё С ^ я >»S-o
io- ° & о н
« ю
к ? л ь
д й§ ^
1 “ S CO
С.СЙЯ ft
I I S <u
+fcig
PJ о t>
+^ftg
+ S S«s 5—2
+ g Я ® fg§.« + 3- Я p_|
S s
5 =r
>.o
a&
лаборатории достаточно иметь всего три типа культур. К ним относятся: 1) первичные или вторичные культуры почки обезьяны; 2) линия эмбриональных фибробла-стов человека; 3) перевиваемая клеточная линия, например клетки HeLa.
Данные о чувствительности этих клеток к вирусам приведены в табл. 4.1. Идеальная клеточная система пока еще не найдена. Однако выбранные типы клеток должны удовлетворять следующим условиям:
1. Должны быть чувствительны к возможно большему числу вирусов; желательно ко всем типам, известным для человека.
2. Необходимо, чтобы неинфицированные клетки сохраняли в культуре нормальную морфологию не менее 14 дней, а после инфицирования через положенный срок в клетках должны выявиться четкие изменения.
3. Должны сохранять жизнеспособность на простых средах при добавлении имеющейся сыворотки.
4. Должны сохранять жизнеспособность при хранении их в жидком азоте.
5. Культуры должны быть свободными от случайно попавших в них агентов, таких, например, как плесневые грибы и вирусы.
ПЕРВИЧНЫЕ И ВТОРИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК
ПОЧКИ ОБЕЗЬЯНЫ
Эти клетки получают из свежих почек различных видов обезьян, чаще всего макак (резус), мартышек (па-тас, зеленой) и циномольгусов.
У обезьян в стерильных условиях удаляют почки, затем отделяют корковое вещество и режут его на небольшие кусочки. Кусочки обрабатывают трипсином, который дезагрегирует эпителиальные клетки. Число клеток в суспензии подсчитывают с помощью гемацито-метра и помещают в питательную среду из расчета 300 000 клеток на 1 мл. Для роста клеток рекомендуют использовать среду 199 с добавлением 5% телячьей сыворотки, pH 7,2.
Суспензию .инокулируют в пробирки или матрасы, по 1 мл в каждую пробирку и соответствующее количество в матрасы. Монослой образуется через 2—4 дня. Образовавшийся монослой сохраняется на среде 199 без сыворотки при условии, что среду меняют по крайней мере два раза в неделю. Культуры, используемые для выделения миксовирусов, перед инокуляцией отмывают от сыворотки, в которой могут присутствовать вирусные ингибиторы.
Вторичные культуры получают из клеток, растущих (в матрасах, засеянных одновременно с пробирками. Клетки снимают со стекла механически или с помощью фермента, подсчитывают и разливают по пробиркам в концентрации 100—300 тыс. клеток на 1 мл. Использование клеток вторичных культур имеет определенные преимущества. Во-первых, из одной почки можно получить много клеток, поэтому нет нужды в большом числе животных. Во-вторых, клетки хорошо растут и не загрязнены обезьяньими вирусами. И наконец, в-третьих, на случай неудачи в процессе работы в термостате можно хранить запасные культуры.
Культуры клеток почки обезьяны можно сравнить в какой-то мере с кровяным агаром в бактериологии. На этих культурах размножается большое число разных вирусов (табл. 4.1). Клетки хорошо растут, быстро образуют монослой и при условии регулярной смены среды сохраняются в хорошем состоянии в течение четырех недель. После хранения в жидком азоте клетки почки обезьяны хорошо возобновляют рост.
В клетках первичной культуры почки обезьяны и в меньшей степени в клетках вторичной культуры накапливаются обезьяньи вирусы, что может мешать при выделении других вирусов. Наиболее часто среди этих контаминантов встречается обезьяний вирус 5, который относится к группе парамиксовирусов. Клетки, зараженные этим вирусом, способны к гемадсорбции. Присутствие вируса 5 в культуре препятствует выделению большинства представителей группы миксовирусов. Добавляя в культуральную среду антисыворотку, специфичную в отношении этого вируса, можно полностью избавиться от него, К другим частым контаминантам относятся
