Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
По-видимому, большинство наиболее важных витаминов принадлежит к группе В. К их числу относятся n-аминобензойная кислота, биотин, холин, фолиевая кислота, никотиновая кислота, пантотеновая кислота, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин я инозитол. Как известно, большинство из них входит в состав коферментов, участвующих в обмене, поэтому некоторые среды со-
держат также коферменты. Среды, в которые не добавляют сыворотку, часто содержат еще и жирорастворимые витамины. Другая важная группа веществ, входящих в состав сложных питательных сред, — это восстановители: глутатион, аскорбиновая кислота и L-цистеин. Широкораспространенными компонентами сред определенного состава являются предшественники нуклеиновых кислот, поскольку синтезировать нуклеиновые кислоты из простых молекул клеткам труднее. О роли сыворотки в среде пока еще нет единого мнения. Ясно, однако, что все многочисленные попытки создать бес-сывороточную среду не привели к положительным результатам: лишь немногие клетки способны расти в отсутствие сыворотки. И даже в том случае, когда удается получить растущую культуру клеток в среде без сыворотки, рост этих клеток значительно усиливается при ее добавлении.
И наконец, еще одна группа компонентов, входящих в состав сред, — антибиотики, которые в метаболизме клеток не участвуют. Во всех средах для культивирования клеток хорошо растут попадающие туда микроорганизмы. Использование антибиотиков предохраняет среды от заражения микроорганизмами. Собственно говоря, нет никаких определенных противопоказаний к применению антибиотиков, однако следует ясно представлять возможные нежелательные последствия этого. Во-первых, антибиотики могут лишь подавить развитие микроорганизмов, а не убить их, в результате чего постоянное применение антибиотиков создаст ложное представление о стерильности. Поэтому время от времени необходимо прекращать добавление антибиотиков в среду с тем, чтобы обнаружить возможную замаскированную инфекцию. Во-вторых, следует помнить, что некоторые антибиотики в эффективных концентрациях токсичны, а некоторые, напри мер микостапин и пенициллин, относительно не стабильны и могут разрушиться, став неэффективными, до того, как закончится эксперимент.
Наиболее широкое применение находят антибиотики пенициллин и стрептомицин, хотя вместо последнего лучше пользоваться дигидрострептомицином, поскольку
он также эффективен, но менее токсичен при тех же концентрациях [12]. Томкинс и Фергюсон [13] предлагают использовать следующие антибиотики: канамицин, неомицин, фунгизон, хлорамфенякол, биомицин и поли-миксин В. Эти антибиотики эффективно действуют на большинство микроорганизмов, попадающих в клеточные культуры.
Более сложная проблема — борьба с микоплазмами, поскольку их труднее обнаружить и от них труднее избавиться. Для обработки культур, зараженных микоплазмой, используют миокризин, который слегка токсичен, и тилозинтартрат [14], который стабилен при +4 °С и может быть использован в концентрациях до 100 мкг/мл. Однако даже эти соединения, а также тетрациклин скорее подавляют, а не уничтожают микроорганизмы, поэтому их следует применять лишь в случае крайней необходимости.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Появление в продаже разнообразных проверенных сред, приготовленных из высококачественных реактивов, избавило исследователей от многих трудностей, связанных с приготовлением питательных сред для клеточных культур. Тот, кто хочет сам проводить эту работу, может пользоваться руководствами [15—17], в которых подробно описаны методы приготовления сложных сред из концентратов совместимых компонентов и получения различных естественных ингредиентов из материала живых организмов. Мы же не намерены касаться этих вопросов и рассмотрим только те проблемы, которые связаны со средами, поступающими в продажу.
Остановимся на некоторых проблемах, относящихся к использованию жидких сред. Обычно их выпускают готовыми к употреблению, либо как десятикратные концентраты. Неконцентрированная среда, как правило, содержит все компоненты и перед использованием ее в качестве ростовой среды в нее необходимо добавить только сыворотку. Так как эти среды обычно содержат антибиотики, их нужно использовать довольно быстро, поэтому при длительных исследованиях приходится
употреблять различные партии. Одна партия может Несколько отличаться от другой, вследствие чего нельзя гарантировать точного воспроизведения условий в каждом последующем эксперименте. То же самое можно сказать и о концентратах сред, но, так как антибиотики и бикарбонат обычно не входят в их состав, такими средами можно пользоваться дольше. Сложные среды определенного состава включают ряд соединений, например глутамин, которые относительно нестабильны в растворе. Эти соединения более стойки при низких температурах, поэтому среду следует хранить при +4°С или, если срок хранения достаточно продолжителен, при —20 °С.
По мере усовершенствования техники культивирования клеток увеличивалась потребность в стандартизованных средах. Первые попытки культивировать в европейских лабораториях линию клеток WI-38, полученную Хей фликом [18], натолкнулись на значительные трудности, обусловленные главным образом различной чистотой компонентов и разными рецептами приготовления сред. Из-за ограничений при хранении жидких сред все большее внимание привлекают среды, изготовляемые в виде сухих порошков [19—21]. В настоящее время судае среды можно получить на разных предприятиях. Готовят их либо с помощью шаровых мельниц, либо методом распыления- или замораживания-высушивания. Щя среды поддерживают рост клеточных культур не хуже традиционно приготовленных сред. Вместе с тем они Обладают и рядом преимуществ: стоимость их невелика, они стабильны и содержат однородные компоненты, ЧТО достигается оптовой покупкой тщательно отобранных ингредиентов, причем расходы на перевозки при этом сокращаются. Сухие среды рекомендуют хранить пр» -tj*4 °С, однако они стабильны долгое время и при комнатной температуре, поэтому их можно пересылать на далекие расстояния. Длительное хранение сред, приготовленных с помощью шаровых мельниц, приводит к неравномерному распределению компонентных частиц. Поэтому лучше покупать среды в количествах, необхо-Щкмх для месячного или недельного пользования. Не-«teoptie фирмы присылают пробы партий сухих сред,
