Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
0,63 °С. Изменения осмотического давления в пределах ±,10% или даже более значительные (если эти изменения происходят медленно) почти не влияют на состояние клеток, и все же давление следует поддерживать на нормальном уровне. Осмотическое давление в клетках животных и в большинстве сред для культивирования Определяется главным образом содержанием хлористого
натрия. Определенную роль играют также другие неорганические ионы и глюкоза. Высокомолекулярные соединения относительно менее важны. Поэтому, если исходить из необходимости поддержания стабильного осмотического давления, то при создании сред легче изменять концентрацию белка, чем концентрацию низкомолекулярных соединений, таких, как глюкоза.
Концентрация ионов водорода в среде должна быть близкой к нейтральной, хотя большинство тканей выдерживает значительные отклонения от pH 7,0. Оптимальная величина pH для нормального роста составляет 7,2—
7,4, и при культивировании некоторых клеток, например линий диплоидных клеток человека, эту величину нельзя превышать. Большинство других тканей, вероятно, не выживает при pH ниже 6,8 и выше 7,6.
Величина pH в культуральной среде контролируется буферной системой, моделирующей естественную буферную систему крови (СОг/бикарбонат). Бикарбонат добавляется к среде как часть сбалансированного солевого раствора, в состав которого обычно входит слабый фосфатный буфер. Эта система работает вполне удовлетворительно и используется в течение многих лет в большинстве культуральных сред; тем не менее она име--ет ряд недостатков. При хранении и использовании среды С02 быстро улетучивается, что приводит к увеличению pH. В закрытых культуральных сосудах количество образующихся в результате дыхания клеток СОг и кислых метаболитов оказывается достаточным для поддержания нужной величины pH. В первичных культурах, однако, величина pH может значительно увеличиваться. Этого можно избежать, либо продувая СОг перед использованием среды, либо инкубируя культуры в открытых сосудах в термостатах, атмосфера которых обогащена СОг.
Кроме того величина р/Са бикарбоната натрия составляет 6,1, что не вполне соответствует физиологическому значению. Все эти недостатки заставили искать новые нетоксичные и нелетучие буферные системы. Одно время использовали глицилглицин [1] и трис-(окси-метил) аминометан [2]. Однако Мартин [3] позже отметил, что доводить pH трис-буферов до нужной величн-
ры лучше с помощью НС1, а не с помощью более токсичных лимонной или малеиновой кислот. При добавлении этого буфера к химически простой и определенной «реде он наблюдал хороший рост клеток. Тем не менее некоторые авторы считают, что при длительном культивировании и глицилглициновый, и трис-буферы токсичны. По мнению Шипмана [4], 4-(2-оксиэтил)-1-пипер-азинэтансульфоновая кислота (ОЭПЭС) имеет значительные преимущества перед ними. ОЭПЭС не токсична во всех проверенных системах, не связывается с металлами, легко растворима при 0°С. Различные клетки хорошо растут в ее присутствии, и она не влияет на последующее титрование вируса или гемагглютинацию. В 1963 г. Лейбович [5] предложил среду, которая используется при свободном газообмене с воздухом. Вместо бикарбоната натрия в эту среду добавляют основные аминокислоты в свободном состоянии, таиие, например, как L-аргинин, L-цистеин и L-гистидин, а образование кислоты снижают, заменяя более окисленные углеводы глюкозой.
К неорганическим ионам, необходимым для выживания, относятся натрий, кальций, магний, железо, а так-карбонат-, фосфат- и сульфат-ионы. Их роль еще не совсем понятна, хотя известно, что они необходимы для Поддержания осмотического давления, прикрепления кле-Щфк поверхности стекла, для активности ферментов, ЩЙаболее распространенным углеводом является глю-Й>за, которая входит в состав большинства сбалансированных солевых растворов. Некоторые более сложные среду, кроме глюкозы или вместо нее, содержат другие СЁШёра или более простые соединения, такие, как молочная, пировиноградная и уксусная кислоты. Весьма существенны для- выживания клеток кислород и двуокись углевода. В большинстве случаев количество растворен-среде кислорода оказывается достаточным, но следует отметить, что в закрытых сосудах для обеспе-чевйя нужной концентрации кислорода в среде нео(5хо-ЯМЙо определенное отношение объема воздуха « объему ЭДиЦры. Двуокись углерода образуется в процессе мета-ЭДЩзма, поэтому потерю ее из среды и потребность в рй установить трудно. Однако имеются достаточные
основания полагать, что для некоторых клеток она абсолютно необходима.
Для длительного поддержания и роста клеток состав среды должен быть более сложным. В сбалансированных солевых растворах клетки сохраняют жизнеспособность в течение относительно короткого периода, но этот период можно значительно увеличить, если добавить в среду сыворотку, желатину, альбумин или метил-целлюлозу [6]. Однако для полного развития потенций клеток и их нормального функционирования необходимо присутствие в среде многих разнообразных компонентов. Среди них наиболее важное значение имеют аминокислоты. Культивируемые клетки млекопитающих, кроме десяти незаменимых аминокислот (аргинина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, треонина, триптофана и валина), нуждаются также в цистине и тирозине [7]. У большинства клеток, особенно трансформированных, резко выражена потребность « глутамине [8]. Перечисленные аминокислоты составляют тот минимум, который необходим для роста клеток; большинство же клеток лучше растет при добавлении других аминокислот. Например, потребности единичных клеток шире, чем потребности клеточных популяций. Локарт и Игл [9] обнаружили, что в среду для роста единичных клеток необходимо включать некоторые другие аминокислоты, например серии. Клетки используют только L-изомеры аминокислот. Присутствие избытка D-изомеров незаменимых аминокислот не дает эффекта. Однако D-изомеры некоторых заменимых аминокислот могут быть ингибиторами [10]. Клетки, зараженные микоплазмой, имеют необычно высокую потребность в аргинине [11], и, возможно, именно этим объясняется относительно высокая концентрация аргинина в некоторых средах.
