Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
i
Ti
0 1 i < 7 ID
Концентрация СЛЬ, °/0
РИС. 17-16.
Зависимость скорости релаксации (1 /Т i) протонов сульфанилацетамида (0,1 М раствор в D2O) от концентрации сывороточного альбумина быка (САБ): кружки соответствуют протонам я-аминобензолсульфонамидной группы; треугольники — протонам метильной группы. [Из работы Jardeizky О Wade-Jardeizky Af. GMol. Pharmacol., 1, 214—230 (1965).]
САБ, ширина линий мет ильного и ароматических протонов существенно возрастает (рис. 17-16), что указывает на уменьшение подвижности этих протонов (табл. 17-2, правило 6). Наиболее простое объяснение изменения ширины линии состоит в том, что увеличение вязкости раствора в присутствии белка приводит к понижению подвижности протонов. Однако это объяснение не может быть правильным, потому что, как показано на рисунке, ширина линии ароматических протонов возрастает быстрее, чем метильных протонов. Если бы уширение было исключительно следствием возрастания вязкости раствора, вызванного добавлением САБ, все линии уширялись бы одинаково; действительно, именно так и происходит, если добавляется у-глобулин (который не связывает сульфанилацетамида). Следовательно, изменение ширины линии, возможно, является результатом избирательного связывания; так как изменение больше для ароматических протонов, ароматическое кольцо, вероятно, является главным местом взаимодействия. Отметим также, что ширина линии может слу-
жить тестом на связывание; действительно, изучение воздействия на ширину линии сульфанилацетамида концентрации как САБ, так и самого сульфанилацетамида, pH и ионной силы позволяет рассчитать константу диссоциации и таким образом определить роль ионных сил в связывании.
Пример 17-Д. Роль кофактора в фермент-субстратном связывании. Дрожжевая алкогольдегидрогеназа превращает этанол в ацетальдегид, но только в присутствии кофактора никотинамид-адениндинуклеотида (НАД). Изучение ЯМР приводит к пониманию роли НАД в этой реакции. Линии протонов никотинамида уширяются при смешивании фермента и НАД. Это уширение специфично к данному ферменту (т. е. с другими белками не происходит) и является, следовательно, результатом связывания кофактора с ферментом, а не эффекта вязкости, упомянутого в примере 17-Г. Если этанол (субстрат) или ацетальдегид (продукт) добавляются к смеси НАД — фермент, линии метильных протонов и субстрата, и продукта уширяются. В отсутствие фермента уширения линий не происходит, так что и субстрат, и продукт должны связываться с комплексом фермент — кофактор* Если фермент, субстрат и продукт смешиваются в отсутствие НАД, уширения линий метильных протонов этанола либо аце-тальдегида не наблюдается. Следовательно, НАД должен связываться с ферментом, чтобы мог связаться субстрат.
Пример 17-Е. Связывание полимера с белком в ДНК-гисто-новый комплекс. ДНК прочно связывается с гистонами, образуя нуклеогистон; это представляет большой интерес в связи с ролью таких образований в построении хромосомы.
Из исследований аминокислотных последовательностей известно, что в большинстве гистонов наблюдается несимметричное распределение аминокислот (т. е. аминокислоты собраны в три кластера — «основной» участок, «кислотный» участок и неполярный участок). Резонансные линии протонов аминокислот этих трех участков можно различить. Если смешать гистоны и ДНК, линии, отвечающие «основному» участку, уширяются. Это нельзя объяснить эффектом вязкости ДНК, поскольку, если бы это было так, все линии уширялись бы одинаково. Тогда можно предположить, что ДНК связывается с «основным» участком гистонов.
Изучение влияния концентрации соли на спектр ЯМР гистонов в отсутствие ДНК показывает, что с увеличением концентрации соли линии неполярных аминокислот уширяются. Это было истолковано так, что гистоны самоассоциируют посредством неполярных районов, образуя агрегаты (табл. 17-2, правила 5 и 6). Из этого разумно предположить, что в хроматине гистоны также ассоциированы посредством неполярных групп, и в таком виде, но уже за счет основных групп связаны с ДНК-
Использование ЯМР для изучения структуры полинуклеотидов
К настоящему времени ЯМР мало использовали для изучения полинуклеотидов, отчасти потому, что (1) ДНК является настолько жесткой и имеет такой низкий коэффициент диффузии, что линии чрезвычайно широки и фактически едва наблюдаются (ее молекулярная масса намного выше предельной массы белков, изучаемых ЯМР, — 25 000); и 2) к тому времени, когда внимание исследователей ЯМР обратилось к нуклеиновым кислотам, мно-
А
С
РИС. 17-17.
Две из нескольких возможных структур аланиновой тРНК Дрожжей, построенные таким образом, что большая часть оснований участвует в образовании водородных связей. Водородная связь G-C-пары обозначена как —г A-U-пары — как более слабые водородные связи, которые образуются в других парах оснований, обозначены как С помощью метода ЯМР» позволяющего определить число пар оснований различного типа, показано, что правильной является структура клеверного листа (слева). Символы: G — гуанозин; С — цитидин; А — аденозин; U — уридин; I — инозин; H2U — дигидроуридин; Т — рибозилтимин; MG — метилгуанозин; M2G — диметил-гуанозин; *?— псевдоуридин; MI — метилинозин. [Последовательность оснований описана в работе Holley R. W., Apgar J., Everett G. А.> Madison V. Т., Margeuisee М., Merrill S. H.} Fenswick J. R., Zamer A., Science, 147, 1462—* 1465 (1965).]
