Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
В настоящее время ЯМР успешно используется для изучения белков в пяти случаях: 1) определение доли аминокислот в
а-спиралыюй конформации с целью подтверждения существования в растворе структуры, установленной по данным дифракции рентгеновских лучей; 2) контроль за переходами спираль — клубок; 3) определение конформации выбранных участков белка (например, вблизи определенной аминокислоты); 4) наблюдение связывания малых молекул и пипов металлов с выбранными участками белка (на основании спектра либо лиганда, либо белка) и 5) исследование парамагнитных активных центров в белках — переносчиках электронов.
Несколько примеров иллюстрируют, какого рода заключения могут быть сделаны и какими методами проводят анализ данных.
Пример 17-А. Доля аминокислот, участвующих в образовании а-спирали в поли-у-бензил-ь -глутамате. В некоторых полипептидах для протона при а-углсроде наблюдаются два различных химических сдвига в зависимости от того, принадлежит ли атом углерода а-спирали или беспорядочному клубку (рис. 17-12). Так как площадь пика пропорциональна числу протонов, дающих данный резонанс, и на звено а-спирали приходится один протон у а-углерода, можно использовать относительные площади двух пиков для расчета доли аминокислот, участвующих в а-спираль-ной конформации. Доля аминокислот равна
^с+ Ак
РИС. 17-12.
Фрагмент спектра поли-у-беизил-ь-глутамата в CDCI3, к которому добавлена трифторуксусная кислота (ТФУ): пик изображает только сигнал протона у а-углерода; С и К относятся к положению линий, отвечающих конформациям а-спирали и беспорядочного клубка соответственно; числа указывают процент добавленной ТФУ.
[Перепечатано с разрешения Ferretti I. Л., Minham В. W.r Parsegian V. Л., Macromolecules, 3, 30—42 (1970)* Copyright by the American Chemical Society.]
5.Ю 6 50
т *
где Ac и Ак — площади пиков спирали и беспорядочного клубка соответственно.
Пример 17-Б. Развертывание белков. Денатурация белков приводит к существенным изменениям в ЯМР-спектрах. Линии становятся уже, так как свобода движения возрастает, а химические сдвиги одинаковых аминокислот приближаются друг к другу. Рассматривая ширину и положение линии как функцию pH, температуры, концентрации различных денатурирующих агентов и т. д., можно проследить за независимым развертыванием различных частей белка.
Например, рассмотрим термическую денатурацию гипотетического белка, в спектре которого содержится несколько линий гистидина (His) и одна линия триптофана (Тгр), соответствующих, допустим, каким-то определенным протонам этих аминокислот (рис. 17-13). Индексы Н и К обозначают положение линий для нативной конформации и конформации беспорядочного клубка соответственно. При 25°С белок находится в нативной конформации и вследствие различного окружения различные ги-стидиновые остатки имеют неодинаковые химические сдвиги. Линия триптофана должна соответствовать нескольким остаткам в одинаковом окружении, так как площадь под ней больше, чем площадь под линией любого гистидина (напомним, что площадь сигнала пропорциональна числу протонов). При 37°С линии гистидиновых остатков сдвигаются до того положения, которое они занимали в беспорядочном клубке. Следовательно, участок белка, содержащий гистидиновые остатки, должен иметь относительно низкую термическую устойчивость по сравнению с участ-
к с
А
11
13
15
1В
17
18
19
20
А Б
IrPw
РИС. 17-13.
А — спектры гипотетического белка при различных температурах. Нарисованы только линии, имеющие отношение к обсуждению. В реальном белке в этом районе может находиться до 50 дополнительных линий. Б — график зависимости положения линии от температуры для каждой линии, изображенной в части А.
ком, содержащим триптофановые остатки. При 45°С появляется линия, соответствующая Тгрк. Так как линия Тгрн остается, остатки триптофана должны находиться по крайней мере в двух различных участках белка, а именно в том, который разрушается при 45°С, и в другом, который не разрушается. Из отношения площадей 1 : 5, отвечающих Тгрк и Тгрн, следует, что !/б триптофановых остатков находится в участке, который при 45°С является беспорядочным клубком. Линия Тгрк по ширине такая же, как и линия Тгрн; это предполагает, что Тгр должен был находиться в очень гибком участке молекулы. Около 65°С линия Тгрн исчезает, следовательно, все участки, содержащие триптофан, денатурированы.
Отметим, что исследование ЯМР дает больше информации, чем можно было бы получить при анализе денатурации гидродинамическими методами. Например, если этот белок изучался бы методом вискозиметрии (гл. 13), мы бы просто наблюдали непрерывное изменение вязкости в том же самом температурном интервале, и это отражало бы усредненное состояние молекулы. Напротив, анализ ЯМР дает информацию о состоянии отдельных участков молекулы.
юь ________-
119 12 /f8/Л1Ш>
У-ЦМФ C(ti)H
