Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
4. Некоторые полимеры могут быть селективно дейтерированы путем выращивания организма на среде, содержащей определенный дейтерированный мономер. В этом случае сигналы протонов дейтерированного остатка исчезнут. Наоборот, организм можно вырастить па полностью дейтерированной среде, за исключением единственного мономера, содержащего протоны, тогда будут видны только пики, соответствующие содержащим протоны фрагментам. Этот метод надежен, но он очень дорогой из-за высокой стоимости дейтерированных соединений.
5. Были измерены спектры белков и полинуклеотидов, пространственная структура которых точно известна из рентгеноструктурного анализа. С ними можно сравнить спектры образцов. Это очень полезный и довольно общий метод с той оговоркой, что структура, установленная по данным рентгеноструктурного анализа, — это структура в кристалле, порошке, либо в ином сухом
материале, в то время как спектры ЯМР получены в растворе. К тому же, имеется не так много макромолекул с точно известной структурой.
Суммируя сказанное, можно сказать, что для идентификации пика никогда не используется один метод; обычно необходимо использовать несколько методов, проявив при этом выдумку и мастерство.
Определение химической структуры малых молекул
Наиболее простым применением ЯМР является определение структуры несложных органических молекул. Для органической химии это обычная методика, но она редко используется в биохимии. Базируется она на том факте, что для простых молекул довольно хорошо определены химические сдвиги таких функциональных групп, как метильная, аминогруппа и т. д. Следовательно, если известна химическая формула, спектр ЯМР может указать на функциональные группы. Наличие мультиплетов спин-спинового расщепления к тому же свидетельствует о близости функциональных групп (как на рис. 17-6). Этот метод не будет обсуждаться здесь, так как его описание можно найти во многих учебниках по органической химии.
Использование ЯМР для изучения структуры белка
Потенциальные возможности метода ЯМР позволяют извлекать большое количество информации о структуре белка, так как параметры спектров чувствительны к изменениям как последовательности, так и конформации. Например, в отсутствие всякого взаимодействия спектр полипептида или белка был бы суммой спектров составляющих аминокислот, каждый из которых хорошо известен. Однако этого не происходит, как видно из рис. 17-11, на котором изображен спектр фермента лизоцима в нативной и денатурированной (беспорядочный клубок) формах и спектр, рассчитанный по аминокислотному составу. Ясно, что существует много различий между наблюдаемым и рассчитанным спектрами — это обычная ситуация. Хотя эти различия меняются от белка к белку, в спектрах имеется несколько общих черт, которые, по-видимому, являются характерными для большинства белков. Например, как правило, большие химические сдвиги наблюдают-
РИС. 17-11.
Фрагмент протонного спектра лизо-цима.
А — рассчитанный; Б — наблюдаемый
спектр денатурированного лизоцима; В — наблюдаемый спектр нативного лизоцима. [Перепечатано с разрешения McDonald С. С., Phillips W. С., J. Amer, Chem. Soc., 91, 1513—1521 (1969). Copyright by the
American Chemical Society.]
В
ся, если протон находится в N- или С-концевой аминокислоте либо по соседству с атомом азота пептидной связи, а маленькие сдвиги имеют место, если протон расположен по соседству либо с атомом углерода пептидной связи, либо с атомом углерода или атомом азота ближайшей соседней аминокислоты. Кроме того, если белок находится в нативной конформации, имеются характеристические химические сдвиги некоторых протонов аминокислот, вызванные расположением аминокислот в а-спирали. К сожалению, величина изменений химических сдвигов, ширины полосы и интенсивности, обусловленных третичной структурой и близостью удаленных аминокислот (например, из-за сдвига, связанного с эффектом кольцевых токов или с водородными связями), неодинакова для разных белков и отсутствуют действительно общие принципы, которые могли бы быть сформулированы в виде эмпирических правил.
То, что на спектры ЯМР аминокислот оказывают влияние вторичная и третичная структура белков, теоретически позволяет определять пространственную структуру белков; однако этого
700 «00 1>U0 400 300 PU0 100 0 “100-200
700 800 500 '.00 300 200 100 0 -100-200
еще не было сделано как из-за большой сложности анализа, так и по следующим причинам.
Во-первых, типичный белок имеет около 850 линий, многие из которых перекрываются. Поскольку на ширину линии влияет подвижность молекулы (.табл. 17-2, правило 6), которая возрастает (грубая оценка) с уменьшением коэффициента диффузии и, следовательно, с увеличением молекулярной массы, пригодные для обработки спектры (в которых линии могут бьггь разрешены) получены в настоящее время только для молекул с молекулярной массой меньше 25 000. Во вторых, для однозначной идентификации линий требуется знать полностью аминокислотную последовательность. Это не всегда возможно, но даже знание аминокислотной последовательности как правило не помогает из-за дополнительных взаимодействий, обусловленных третичной структурой. Для идентификации сигналов проводят избирательное дейтерирование или изучают наблюдаемые при титровании определенных аминокислот изменения химических сдвигов. Но эти приемы не всегда помогают. В результате в сложном белке остается неидентифицированным значительное число линий. Тем не менее из спектров может быть получено много информации.
