Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
ДОВ и КД чрезвычайно чувствительны к конформационным изменениям полинуклеотидов. Так, например, в течение многих лет наиболее обычным путем анализа конформационных измене-
X, нм
РИС. 16-12.
Спектры КД аденнловой кислоты (1), полиадениловой кислоты [poly (А)] (2) и денатурированной poly (А) (5). Отметим изменение знака эффекта Коттона при полимеризации адени-ловой кислоты и значительное увеличение эллиптичности в случае неде-натурированной структуры.
ний полинуклеотидов было изучение гипохромии — уменьшения оптической плотности, сопровождающее образование упорядоченной структуры (см. гл. 14). Оптическая плотность полиадениловой кислоты, poly (А), при 258 нм на 26% меньше, чем плотность мономера — аденнловой кислоты. Отличие КД для тех же веществ показано на рис. 16-12. Обратим внимание на инверсию знака эффекта Коттона и увеличение 0. Ясно, что эти изменения намного превышают те, что наблюдаются при изучении поглощения. Изменения 0 такого рода можно использовать для исследования: 1) разрушения спиральной структуры полинуклеотидов под действием различных агентов, таких, как высокая температура или экстремальные значения pH (отметим видные на рис. 16-12 большие изменения спектра КД poly (А) при денатурации); 2) перехода одноцепочечных полинуклеотидов в двухцепочечные и наоборот; 3) структурных изменений полинуклео-тидных цепей под влиянием связывания катионов, пептидов, белков и т. п. и 4) эффекта «нагружения» тРНК аминокислотой.
Для одноцепочечных полинуклеотидов существует приемлемая теория (теория Игнацио Тиноко), связывающая спектры ДОВ и КД со структурой. Недавно эта теория была подтверждена во всех деталях, и в настоящее время она позволяет вычислить с некоторой степенью точности спектр КД исходя из молекулярной структуры. Наиболее важный элемент этой теории заключается в том, что оптическая активность олигонуклеотидов есть ре-
РИС, 16-13.
Три основания в стэкинг-конформации (Л); структура полинуклеотидов, имеющих стэкинг-конформацию (?) и не имеющих ее (В). Полинуклеотиды в стэкинг-конформации являются более протяженными, так как вследствие стэкинг-взаимодействий оснований уменьшается гибкость молекулы.
зультат взаимодействия двух соседних оснований — ближайших соседей,— которые уложены в стопку друг над другом ('рис. 1G-
13). Взаимодействие следующих оснований (т. е. оснований, разделенных ближайшим соседом каждого) не вносит существенного вклада. Зная спектры КД всех пар ближайших соседних оснований (т. е. спектры динуклеозидфосфатов) и частоту ближайших соседей, можно путем простого суммирования рассчитать спектр КД одноцепочечного полинуклеотида. Если бы можно было с помощью вычислительной техники из спектра КД определить частоту ближайших соседей, это представляло бы огромную практическую ценность при определении последовательности оснований. Точность анализа методом КД не превышает обычные ферментативные методы, но для получения спектра КД требуется несколько часов, а для выполнения ферментативного анализа — около недели при наличии очищенных ферментов. Для двухцепочечных полинуклеотидов разработка теории еще не завершена, хотя прогресс идет быстрыми темпами. Для двухцепочечных ДНК в обычно рассматриваемой области длин волн спектры КД, по-видимому, не зависят от состава оснований, хотя по недавно полученным данным в далеком (вакуумном) ультрафиолете такая зависимость возможна.
Примеры использования методов ДОВ и КД для изучения структуры полинуклеотидов
Рассмотрим несколько примеров использования ДОВ и КД для определения структурных особенностей полинуклеотидов.
Пример 16-Г. Структура полицитид иловой кислоты — ро-1у(С). Из спектров ДОВ poly(C) можно определить, что [mf]292 = = 35160; согласно правилам 2 и 3 (табл. 16-1) это означает, что poly (С) имеет очень асимметричную структуру, которая в случае полинуклеотидов представляет собой спираль. С помощью спектрального анализа легко установить, какие силы способствуют формированию спирали. Например, при добавлении формальдегида, который оксиметилирует аминогруппы и таким образом препятствует образованию водородных связей, [т'\292 практически не меняется. Следовательно, спираль стабилизируется не водородными связями. Однако в 90%-ном этиленгликоле — реагенте, который, как известно, мешает взаимодействию неполярных (гидрофобных) групп, [т'\292 = 7223, т. е. в пять раз меньше, это значит, что асимметрия (т. е. спиральность) резко понизилась. [т']292 мономера, цитидиловой кислоты, составляет, как в Н2О, так и в 90%-ном этиленгликоле примерно 8000. Следовательно, структура полимера стабилизируется так называемыми гидрофобными силами. Стабилизация гидрофобными силами означает, что взаимодействующие молекулы проявляют тенденцию 'располагаться так близко, чтобы между ними не было молекул воды; таким образом, этот результат дает возможность предположить, что основания в poly(C) расположены одно над другим и что они находятся относительно близко, т. е. имеет место стэкинг-конформация (рис. 16-13,5).
Предположим, что эффект рассмотренных выше реагентов был изучен не методом ДОВ, а путем простого определения изменений поглощения. При добавлении формальдегида Z)26о возрастает примерно на 10%, но причиной этого могла явиться как потеря спи'ральности, так и изменение поглощения самого цитозина (поскольку титрование формальдегидом свободных оснований приводит к возрастанию поглощения). Следовательно, никакого заключения о роли водородных связей не может быть сделано. Возрастание D260 при добавлении этиленгликоля (слабополярного растворителя) составляет 30%. Это даст возможность предположить наличие гидрофобных взаимодействий, но без данных ДОВ нельзя доказать, что реагент оказывает воздействие па спиральность.
