Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Из материала следующего раздела очевидно, что другим важным применением ДОВ и КД в случае белков является исследование конформационных изменений, к которым эти методы чрезвычайно чувствительны.
Изучение конформационных изменений методом КД
Хотя метод КД редко дает полную информацию о структуре и всегда необходимо проводить сравнение со стандартами, структура которых определена методом рентгеноструктурного анализа, КД чрезвычайно чувствителен к изменениям конформаций — если каким бы то ни было образом меняется конформация, должно произойти изменение спектра КД. Следовательно, даже если структура совсем не известна и кривая КД фактически не поддается интерпретации, КД тем не менее остается чувствительным методом обнаружения любых взаимодействий и агентов, вызывающих конформационную перестройку. Это можно сделать полуколичественно, рассматривая, как изменяются раз-
личные характеристики спектра. Следовательно, можно задумывать опыты, в которых изменение КД будет служить переменной. Как это делается, лучше рассмотреть на примере.
Пример 16-А. Изменения структуры фермента, вызванные веществами, которые с ним связываются. Спектры КД многих ферментов меняются, когда фермент взаимодействует с субстратом, коферментом или ингибитором. Это можно использовать для исследования процесса связывания. Например, измеряя силу вращения в зависимости от концентрации связанных молекул, можно определить константы связывания. Так как каждая связанная молекула изменяет R на определенную величину, из величины суммарного изменения можно определить число связанных молекул. В тех случаях, когда изменения КД малы, их можно усилить, вводя в активный центр или недалеко от него оптически активный хромофор или хромофор, который становится оптически активным при связывании с белком, и изучая затем изменения КД этого хромофора. Таким путем можно, кроме того, идентифицировать активные центры; для этого в различные участки белка вводят хромофор и определяют, в каком участке связывание субстрата оказывает влияние на КД. Методика во многом похожа на метод репортерных групп, применяемый в абсорбционной спектроскопии (гл. 14). Можно предположить следующую ситуацию. В белке имеется 4 гистидина и один из них находится в активном центре. Вводя хромофор (часто с трудом) по соседству с одним из гистидинов, исследуют КД хромофора до и после связывания субстрата. Если пет влияния на спектры КД хромофора, находящегося по соседству с гистидинами 1, 2 и 4, но есть в случае гистидина 3, это может свидетельствовать о присутствии гистидина 3 в активном центре. Отметим, однако, что эти эффекты экспериментально трудно уловить.
Пример 16-Б. Денатурация белка. Денатурация белков всегда сопровождается изменениями КД, которые означают, что происходят потеря а-спирали и p-структуры и увеличивается вклад в спектр от форм, соответствующих беспорядочному клубку. Следовательно, можно проследить за денатурацией, откладывая зависимость эллиптичности при определенной длине волны от условий денатурации. На рис. 16-11 приведен пример денатурации миоглобина под действием изменяющегося pH.
Пример 16-В. Изучение образования пространственной структуры белков. Большой интерес представляют силы, участвующие в формировании пространственной структуры белка. Этот процесс обычно изучался путем рассмотрения переходов спираль — клубок. Метод КД открывает новые возможности в этих исследованиях, потому что, если известна последовательность аминокислот, можно непосредственно рассматривать окру-
РИС. 16-11.
Обнаружение денатурации миоглоби-на при титровании кислотой путем измерения молярного вращения при 233 нм. [Из работы Appel P., Brown W. D., Biopolymers, 10, 2309—2322 (1971).]
pH
жение ароматических аминокислот и дисульфидных связей, имеющих полосы КД при характерных длинах волн. Отсюда в принципе появляется возможность обнаружить по соседству с определенными аминокислотами изменения, вызванные разрушением гидрофобных сил или водородных связей, титрованием отдельных аминокислот и т. п. В качестве примера рассмотрим поведение тирозина в панкреатической рибонуклеазе. Этот остаток расположен далеко от активного центра фермента, но его КД меняется при добавлении ингибитора — З'-цитидиловой кислоты, которая связывается с активным центром. Таким образом, связывание с одним участком белка может приводить к конформацион-ной перестройке в удаленной части молекулы.
Измерение ДОВ и КД в случае полинуклеотидов, нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов
Оптически активными группами, которые наблюдают при исследовании всех полимеров, содержащих нуклеотиды, являются пурины и пиримидины, так как связи в сахарах и фосфоэфир-ные связи не поглощают в обычно изучаемом диапазоне длин волн. Сами по себе пурины и пиримидины являются примерами симметричных хромофоров, которые становятся оптически активными в результате присоединения к сахару посредством N-гликозидной связи; кроме того, их оптическая активность существенно возрастает при образовании спиральных структур.
