Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 135

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 129 130 131 132 133 134 < 135 > 136 137 138 139 140 141 .. 218 >> Следующая

Для белков, подвергнутых денатурации в 6 М растворе хлорида гуанидиния (вещество, которое разрывает все водородные связи так, что белок превращается в статистический клубок, если отсутствуют дисульфидные мостики внутри одной полипептид-ной цепи), а и К хорошо известны из большого числа опубликованных работ. Отношение обычно записывают в следующем виде:
[т^ОЛбп0^6, (10)
где п — число аминокислотных остатков в белке. Среднюю молекулярную массу на один остаток можно определить из аминокислотного состава, тогда как М можно вычислить из т]. Это соотношение можно использовать также для того, чтобы определить другие свойства белков, как это будет показано в примерах 13-А и 13-Б.
Для двухцепочечных линейных молекул ДНК было найдено, что соотношение между [г|] и М можно записать следующим образом:
0,665 lgM - 2,863+ lg([T]] 4“ 5). (11)
Это истинно эмпирическое уравнение можно использовать для вычисления М при условии, что образец ДНК гомогенен по мо-
лекулярной массе. Это ограничение следует иметь в виду вследствие большой чувствительности ДНК к деградации при деформации сдвига, вызванной в процессе выделения и очистки (гл. 18).
Примеры использования вискозиметрии
Вискозиметрию можно количественно применять для определения молекулярной массы или полуколичественно для установления формы или для того, чтобы увидеть изменения молекулярной массы или формы. Молекулярную массу рассчитывают из графиков типа тех, что приведены на рис. 13-2 и 13-3, т. е. т]0тн измеряют при нескольких значениях с и G, а [т]] определяют для каждого значения G экстраполяцией отношения т]уд/с к с = 0 со второй экстраполяцией в дальнейшем к G = 0. Это просто и не будет дальше объясняться. Следующие примеры показывают полуко-личественное применение вискозиметрии. Основное правило, которым при этом руководствуются и которое было сформулировано выше,— увеличение или уменьшение вязкости характеризует соответственно увеличение или уменьшение осевого отношения. В примерах следует отметить, что этот вид информации может быть часто получен путем измерения одной только tiotii*
Пример 13-А, Определение общей формы белков. Как уже обсуждалось в гл. I, белки можно условно разделить на очень компактные, статистические клубки, спиральные и полужесткие (или комбинацию трех последних). Представление об общей форме может быть получено из сравнения вязкости нативного и денатурированного белка. (Денатурацию можно вызвать действием кислоты, высокой температуры или денатурирующих агентов, таких, как хлорид гуанидиния). Поскольку денатурированная форма представляет собой статистический или около-статистический клубок (см. пример 13-Б для их различия), можно определить, является ли нативная форма более или менее компактной по сравнению со статистическим клубком по тому, увеличивается или уменьшается вязкость при денатурации. Например, т]0тн рибонуклеазы заметно увеличивается в процессе термической денатурации в кислоте; отсюда следует, что она имеет компактную нативную структуру (которая характерна для большинства глобулярных белков). С другой стороны, вязкость поли -у-бензил-?-глутамата, имеющего форму жесткого стержня, в 4 раза уменьшается, если его поместить в условия, в которых он превращается в статистический клубок. Аналогично вязкость
белка коллагена и ДНК, очень жестких тройной и двойной спиралей соответственно, заметно уменьшается при денатурации. (Заметьте, однако, неявное предположение, что условия денатурации не приводят к какой-либо степени деполимеризации и что уменьшение вязкости обусловлено только изменением конфигурации. Это не всегда так; например, при низких pH, при которых имеет место денатурация ДНК, также происходят одноцепочечные разрывы, и, следовательно, этого следует избегать, если желательно произвести просто денатурацию.)
Пример 13-Б. Обнаружение внутрицепочечных дисульфидных мостиков в белках. Остатки цистеина в белках часто связываются дисульфидными мостиками. Эти дисульфидные мостики предохраняют белок от перехода к полностью неупорядоченной конфигурации клубка при денатурации, особенно в тех случаях, когда остатки цистеина разделены большим числом других аминокислот.
Такую молекулу можно определить как почти статистический клубок, потому что он более компактен, чем истинный статистический клубок. Дисульфидные мостики разрушаются при восстановлении 2-меркаптоэтанолом, а повторное замыкание получающихся сульфгидрильных (SH) групп можно предотвратить S-карбоксиметилированием иодацетамидом. Следовательно, если в нативной структуре имеются дисульфидные мостики, вязкость в 6 М хлориде гуанидиния будет больше после обработки меркаптоэтанолом, потому что молекула будет менее компактной. Например, тубулин из мозга теленка имеет [т]] = 36,0 мл/г до восстановления и 44,0 мл/г после восстановления, что свидетельствует о присутствии дисульфидных мостиков.
Из величин ft] восстановленной и невосстановленной форм можно получить информацию о расстоянии между остатками цистеина, связанными S—S-связыо. Было вычислено, что отношение [rj] для отдельного линейного полимера в конфигурации статистического клубка к величине [г\] для кольцевой структуры составляет 1,6. Следовательно, в примере тубулина, поскольку величина 44,0 соответствует прямой цепи (т. е. нет S—S-связей), то для кольцевой структуры (т. е. если S—S-мостик соединяет концевые аминокислоты) это значение должно быть [rj]= = 44,0/1,6 = 27,5. Поскольку наблюдаемая величина составляет 36,0, ясно, что S—S-мостик связывает не концевые аминокислоты. Если эти связи соединяют близкие аминокислотные остатки, они будут оказывать малое влияние и значения [rj] окажутся очень близкими к 44,0 (и, возможно, неотличимыми). Следовательно, S—S-мостики не связывают близлежащие аминокислоты. Поскольку [т]] имеет величину, среднюю между 27,5 и 44,0, можно заключить, что, если имеется один или небольшое количество
Предыдущая << 1 .. 129 130 131 132 133 134 < 135 > 136 137 138 139 140 141 .. 218 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed