Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Пример 11-Т. Изучение рекомбинации у фага К Е. coli. ДНК фага К содержит центр, называемый att, у которого происходит рекомбинация, катализируемая ферментом интегразой. Полагают, что такой обмен включает разрыв двух молекул ДНК и последующее соединение фрагментов. Справедливость этой гипотезы была проверена путем скрещивания фага дикого типа с мутантом, который содержал две делеции (Ь2 и Ь5), что показано на рис. 11-44. Эти делеции достаточно велики для значительного воздействия на плотность фага в CsCl. В описываемом эксперименте все другие системы рекомбинации были устранены мутацией, так что активной осталась только система интегразы. Как показано
/ 3
Дно Номер фракции
РИС. 11-44.
Разделение родоначальных и рекомбинантных фагов центрифугированием в CsCl.
Фаг ЛЬ2Ь5 метили 3Н и скрещивали с нерадиоактивным фагом ЛЬ+. В результате оказалось, что 3Н связывается с рекомбинантной ДНК, а это указывает на способность родоначальной ДНК входить в состав рекомбинантной (Kellenberger-Gujer G., Weisberg R. А., in “The Bacteriophage Lambda”, ed. A. D. Hershey, Cold Spring Harbor Laboratory, 1971, pp. 407—415]. / — родоначальный b+; 2 — рекомбинанты; 3 — родоначальный Ь2Ь5.
на рис. 11-44, фаг ХЪ2Ъ5, меченный с помощью 3Н-тимидина, скрещивали с нерадиоактивным фагом дикого типа в Е. coli. После лизиса инфицированных клеток освобожденные фаги анализировали в CsCl. В результате такой инфекции было получено четыре фага: Ь2Ь5 (родоначальный), Ь2+Ь5+ (родоначальный) и рекомбинантные, Ь2Ь5+ и Ь2+Ь5. Кроме того, они содержат либо всю родоначальную ДНК (т. е. нереплицированную), либо реплики. Хотя этот эксперимент дает значительную информацию, остается неясным, всегда ли в рекомбинантах находится первичная ДНК. Поскольку все четыре типа фагов имеют различные плотности, их легко можно различить, при этом необходимо только выяснить, находится ли 3Н в зонах, соответствующих рекомбинантам. Рис. 11-44 это подтверждает тем, что ДНК из Ь2Ь5 появляется в рекомбинантах. Если эксперимент повторить с 3Н в родоначальном Ь2+Ь5+, то снова 3Н будет найден в рекомбинантах. Это означает, что в рекомбинантах присутствует вклад ДНК обоих родоначальных фагов.
РИС. 11-45.
Равновесная седиментация фрагментов ДНК фага X в CS2SO4, содержащем Hg2+.
Различные зоны соответствуют различным участкам ДНК фага Я Е. coli. Заметим, что ДНК с высоким содержанием G-С имеет меньшую плотность, чем ДНК с низким содержанием этих пар, в Cs2S04—Hg2+ в противоположность CsCl. При аналогичном исследовании фрагментов, полученных из очищенных левой и правой половин и четвертей ДНК, зоны с различной плотностью были отнесены к специфическим участкам ДНК фага I. ISmlka А. М., Hershey A. D., Burgi Е. A., J. Mol. Biol., 34, 1—16 (1968)].
Различия в плотностях могут быть увеличены несколькими способами:
1. Разделение молекул ДНК в растворах Cs2SOA) содержащих соли Hg2+ или Ag+. Ионы Hg2+ обладают способностью прочно связываться с парой оснований аденин — тимин (АТ). Из-за высокой плотности этого иона плотность комплекса Hg2+— АТ будет намного больше, чем пары G-С. При правильном выборе концентрации Hg2+ различия в плотности существенно возрастут. Ион Ag+ связывается с парой G-С и используется сходным образом.
Пример 11-У. Выделение избранных участков ДНК фага К с помощью центрифугирования в CS2SO4, содержащем Hg2+. Если ДНК фага К Е. coli расщепить на мелкие фрагменты путем гидродинамического фрагментирования или действием ультразвука (гл. 18), фрагменты можно разделить на группы со сходными плотностями с помощью центрифугирования в CS2SO4, содержащем Hg2+. Это фракционирование происходит за счет различных соотношений пар АТ и G-С в различных областях Л-ДНК. Необычное разделение, достигаемое с использованием этого метода, показано на рис. 11-45.
2. Разделение индивидуальных полинуклеотидных цепей ДНК путем образования комплексов с полирибонуклеотидами и центрифугирования в Cs2SO4. Различие в плотности между отдельными полинуклеотидными цепями редко бывает достаточно
РИС. 11-46.
Разделение комплементарных цепей ДНК фага К при образовании комплекса с поли-ИГ (смешанный полимер инозиновой и гуаниловой кислот).
ДНК денатурировали нагреванием при 95°С. В части А ДНК седиментировали до равновесия в CsCl; при этом получалась одна зона в положении Д (денатурированная ДНК); Н — положение зоны нативной ДНК. В части Б денатурированную ДНК перед центрифугированием в CsCl смешивали с эквимолярным количеством поли-ИГ. В результате плотность повышается, так как поли-ИГ обладает большей плотностью, чем ДНК. Две цепи — Т (тяжелая) и Л (легкая) — связывают различные количества поли-ИГ, что приводит к образованию зон с различной плотностью. Эти две зоны можно разделить капельным фракционированием и отделить от поли-ИГ обработкой панкреатической РНазой, после чего получаются чистые цепи Т и Л. В ранних работах цепи Т и Л обозначали С и W по начальным буквам фамилий Крика и Уотсона. Эта широко распространенная методика разработана Вацлавом Шибальским.
