Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
информации.
2. Солюбилизация мембранных белков
Как указано в разд. 1, первый этап очистки того или иного мембранного
белка обычно включает выбор подходящего биологического источника и
выделение мембранной фракции, обогащенной данным белком. На следующем
этапе проводят солюбилизацию детергентами, и поэтому целью данного
раздела является теоретическое и практическое рассмотрение проблемы
солюбилизации интегральных мембранных белков.
С физико-химической точки зрения солюбилизация представляет собой
"процесс получения термодинамически устойчивого изотропного раствора
вещества, обычно нерастворимого в данном растворителе, путем введения
добавок амфифильного компонента или компонентов" [6]. Такое определение
применимо и в отношении солюбилизации и реконструкции биологических
мембран, которые состоят из липидов и белков, нерастворимых в воде.
Подходящими амфифилами в данном случае являются детергенты. При
добавлении к биологической мембране детергент обычно включается в нее до
достижения точки насыщения, после чего мембрана начинает распадаться на
смешанные мицеллы детергент - липид - белок (см. рис. 5.1, а также работы
[7, 8]).
2.1. Критерии солюбилизации
Чаще всего о солюбилизации судят по появлению белка или соответствующей
биологической активности в надосадочной жидкости после высокоскоростного
центрифугирования, обычно при 105 ООО g в течение 1 ч [4]- Большинство
мембран в этих условиях осаждаются, и таким образом можно отделить
солюбилизированный материал от несолюбилизированного. Однако следует
помнить, что такой критерий солюбилизации не является строгим, поскольку
полнота осаждения может зависеть от многих факторов, например от
температуры и плотности среды и, в частности, от присутствия таких
добавок, как сахароза и глицерол.
Существуют и другие критерии солюбилизации. Гель-фильтрация на носителях
с крупным размером пор дает возможность отделить нерастворимый (или
агрегированный) материал, вы-
Солюбилизация п реконструкция мембранных белков
199
ходящий в свободном объеме колонки, от солюбилизированного, который
задерживается в геле [4, 9]. Но и в этом случае различие между
растворимой и нерастворимой фракциями остается нечетким и будет зависеть
от способности данного геля фракционировать частицы по размеру.
В принципе можно было бы легко отличить солюбилизированный материал от
несолюбилизированного с помощью электронной микроскопии. Однако обычные
методы подготовки препарата для микроскопирования могут привести к
разбавлению детергента и в результате к частичной реконструкции мембран
Липидно-белковая мембрана Неидеальное смешивание Фрагментация
Рнс. 5.1. Схема взаимодействия детергентов с биологическими мембранами.
При солюбилизации мутность раствора обычно значительно уменьшается, что
можно зарегистрировать по уменьшению светорассеяния образца либо по
увеличению его светопропускания. Однако даже при полной солюбилизации
белков раствор может не быть оптически прозрачным из-за присутствия
крупных мицелл, которые содержат как белки, так и липиды.
Очень перспективным для контроля за полнотой солюбилизации с помощью
детергентов является, по-видимому, метод 31Р-ЯМР [11, 12J. О ходе
солюбилизации можно судить по превращению широкого ЯМР-сигнала,
характерного для фосфолипидов в составе мембран, в узкий пик, который
дают фосфоли-
[Ю].
Детергент
Детергент
ООО
о
о
о
о о 0 о
(c) (c)Л 0
в Детергентно-белковые
а мицеллы
детергентныр мицеллы
Смешанные мицеллы детергент-липид- белок
200
Глава 5
'Y^o' Co-Д. 0"
ДСН
,о-"-о' n ъ* Додецилсуль-фат натрия Лаурилсуль-(рат натрия
Халат о за ,1а, 12а-- Тригидропси--5р -холаноат-24
Лезансихолат 3cL,12ct-- + Дигидрокси-5Na -5р-
холаноат-24
ЦТАБ
Гексадецил-триметил-аммоний-Брамид сн Цетримид
1±сн Лизс-сх ' | 3 Лизпфосфа-
сн3 тидилхалин Лизалецитан
J} CHAPS ¦ - -о" J-КЗ -Холами-долролал) -ди-метиламмо-ний]-1-
прелипсилыра -нагл
о Цвиттергент ,5-0- 3-14
II Н-тетраавцил 0 -N, N-оиметил-
-З-симаний-1-прапилсулыра-нат
Рис. 5.2. Структурные формулы и названия широко используемых детергентов.
пиды в мицеллах. К сожалению, ЯМР-спектрометры имеются далеко не во всех
лабораториях.
При солюбилизации детергентами возникает вопрос о возможности
избирательного извлечения из мембраны именно тех компонентов, которые
интересуют исследователя. Известно, например, что с помощью неионного
детергента С^Ев (см.
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
201
сн2он 0Г '1 • Октилглюкомд
1-о-а"тля-
он он ^глюксл^рсгсзид'
Дигитонин
СИ.
,(сн2)CH=CH<CH2)/v-0 (CHjCHjOV^J^^
С12 ЕВ
Дадецилаоый до сн2сн2)6он эфир акта-этиленглико-ля АтлпсБ2121
АО сн,сн,)он ЛуВралРХ _
¦ 9-ю ДоВецилоВыи эфир полиэти-ленгликалй(В-1D)
(осн2сн2)он Тритон х-700 9-то п-(Трет-онтил)-фени-лоВый Эфир полиэтилен-
гликоля (S-W)
тВинвО
Манаалеат
¦ . сарбитанноли-
но гит. НоСО)'^' этленглинолл
но chjCн2со"20 (0СН2СН2,он (20)
(О СН2СН2) он • 20
рис. 5.2) не удается избирательно удалить липиды из мембран
