Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 89

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 191 >> Следующая

СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ И РЕКОНСТРУКЦИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ
Оуен Т. Джонс, Юли П. Эрнест, Марк Дж. Мак-Нэми
1. Введение
Очистка и характеристика мембранных белков ставят перед исследователем
целый ряд специфических проблем, с которыми он обычно не сталкивается,
работая с растворимыми белками. Мембранные белкн, как правило, прочно
связаны с лнпндным бислоем и фактически нерастворимы в воде. Поэтому для
их солюбилизации и очистки приходится применять детергенты или другие
разрушающие мембрану вещества. В соответствии с жидкомозаичной моделью
структуры мембран [1] такие белки называют интегральными. Именно о них
прежде всего и пойдет речь в этой главе.
Поскольку выделение интегральных белков обычно сопряжено с разрушением
мембраны, во многих случаях необходимо убедиться, что в процессе
выделения и очистки белка его функциональная активность не оказалась
нарушенной или утраченной. Для этого, в частности, можно попытаться
провести реконструкцию, т. е. встроить очищенный белок обратно в
мембрану. Функциональную активность некоторых мембранных белков, таких,
как ионные каналы или транспортные белки, можно охарактеризовать и
измерить только в реконструированных мембранных системах. Для других
мембранных белков, выполняющих функции ферментов или рецепторов, полезную
информацию часто можно получить, используя солюбилизированные препараты.
Методы солюбилизации и реконструкции не только дают ценную информацию о
функциях мембранных белков; их можно также использовать для того, чтобы
перевести эти белки в состояние, удобное для проведения детального
структурного анализа. Несомненно, детергенты будут играть ключевую роль в
совершенствовании методов кристаллизации мембранных белков для
последующего рентгеноструктурного анализа Г2].
Конечно, необходимость проведения солюбилизации и реконструкции создает
определенные сложности при исследовании мембранных белков. Но, с другой
стороны, мембранным системам присущ ряд особенностей, благодаря которым
задача ха-
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков_____________197
рактеристнки белков, осуществляющих тот или иной сложный биологический
процесс, в значительной мере облегчается. В настоящее время разработаны
эффективные методы разделения различных мембран по размеру, плотности,
поверхностному заряду и другим физическим параметрам (гл. 1). С их
помощью удается обогатить мембранную фракцию с необходимой функциональной
активностью в 10-100 раз, не нарушая целостность мембраны. Имеющиеся
сейчас методы гомогенизации тканей, разрушения клеток и фракционирования
мембран позволяют сравнительно легко определять субклеточную локализацию
функционально важных мембранных структур. В некоторых случаях (например,
для высших растений) именно трудности очистки и функциональной
характеристики различных мембран были главным препятствием на пути
выделения мембранных белков, но сегодня и здесь уже достигнуты
определенные успехи [3, 4] (гл. 1 и 2).
В этой главе мы опишем некоторые экспериментальные подходы, оказавшиеся
полезными при солюбилизации, очистке и реконструкции мембранных белков. К
сожалению, сейчас не существует какого-либо одного детергента или единого
метода реконструкции, который оказался бы применимым ко всем без
исключения мембранным белкам. В этом отношении исследование мембранных
белков пока остается скорее искусством, чем наукой. Мы постараемся дать
необходимые сведения о наиболее широко используемых детергентах и
предложить практические рекомендации по их применению. В тех случаях,
когда это возможно, будут изложены общие принципы работы с детергентами и
обсуждены границы применимости лежащих в их основе теоретических
представлений.
В данной главе рассмотрены также критерии, по которым можно судить об
успешности реконструкции. При разработке метода определения активности
реконструированного белка следует принимать во внимание такие аспекты,
как гомогенность мембранного препарата, размер частиц, характер
распределения и ориентации белковых молекул в мембране, целостность
мембраны и т. д. Не вызывает сомнения, что все эти важные параметры
зависят (иногда непредсказуемым образом) от природы детергентов и
липидов, а также от методов, используемых для солюбилизации и
реконструкции.
В главе широко представлены примеры, касающиеся различных мембранных
систем. Но собственный опыт авторов накоплен прежде всего в ходе работы с
никотиновым ацетилхолино-вым рецептором из электрических органов ската
Torpedo cali-fornica. Это один из наиболее охарактеризованных мембранных
белков, и с точки зрения реконструкции мы будем рассматривать его как
модельный объект. В последние годы было опубли-
198
Глава 5
ковано несколько работ, в которых сделана попытка пролить свет на
довольно запутанную и противоречивую проблему использования детергентов в
реконструкции мембран [4, 5]. В тех случаях, когда какие-либо
теоретические и практические вопросы реконструкции не находят
достаточного отражения в данной главе, мы даем ссылки на другие источники
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed