Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
(этаноламин, холин, серии) с удельной радиоактивностью около 106
расп./мин на мкмоль и 1,0 мМ СаС12 в HEPES-буфере (pH 7,4), содержащем
0,25 М сахарозу.
2. После включения меченых предшественников в мембраны реакцию можно
остановить добавлением избытка немеченого предшественника к инкубационной
среде илн выделением мембраны с помощью центрифугирования.
13-1488
194
Глава 4
9.2. Определение локализации новосинтезированных фосфолипидов
После мечения фосфолипидов в условиях in vivo субклеточные органеллы,
подлежащие исследованию, приходится выделять (гл. 1). Мембраны, меченные
in vitro, исследуют без дополнительной очистки.
Для анализа включения предшественников мембранные липиды экстрагируют,
разделяют их с помощью ТСХ, элюируют отдельные фосфолипидные фракции и
определяют их удельную радиоактивность. Так можно определить скорость
включения предшественников в различные фосфолипиды.
Относительное содержание меченого фосфолипида на наружной стороне
мембраны и удельную радиоактивность наружного и внутреннего пула того или
иного фосфолипида можно определить с помощью фосфолипаз, химических
модифицирующих реагентов или фосфолипндпереносящих белков (см. выше). Как
и при исследовании трансмембранного распределения фосфолипидов,
необходимо проводить контрольные эксперименты на незамкнутых мембранных
везикулах. Новосинтезированные, т. е. меченые, фосфолипиды, недоступные
для зонда в замкнутых везикулах, должны стать доступными после нарушения
их целостности.
Фосфолипиды накапливаются внутри субклеточных частиц (особенно в
мембранах Гольджн) н в меньшей степени в эндо-плазматическом ретикулуме.
Чтобы определить степень захвата меченых липидов, мембранные везикулы
следует сделать проницаемыми с помощью карбоната натрия или продавливания
через пресс Френча (см. выше). Мембранные фракции выделяют длительным
центрифугированием (например, 2 ч при 105 000 g) с повторным
центрифугированием супернатанта (1 ч при 105 000g),чтобы произошло полное
отделение мембран от содержимого везикул. Из надосадочной жидкости липиды
экстрагируют по методу Блая-Дайера [4], а из мембран--с помощью смеси
хлороформ/метанол (2:1). Эта методика позволяет определить содержание
меченых фосфолипидов в субклеточных органеллах на обеих сторонах их
мембраны и в секретируемом материале. Таким способом можно изучать
взаимные превращения мембранных фосфолипидов и возможные пути
трансформации предшественника в продукт в различных мембранах и тканях.
Литература
1. Berridge М. Irvine R. F. (1984). Nature, 312, 315.
2. Hirata F. (1985). In: Phospholipids of the Nervous System. Horrjcks I
. A,
Kanfer J. N., Porcellatti G. (eds.), Raven Press, New York, Vol. II, p.
99.
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
195
3. Folch Lees М., Sloane-Stanley G. Н. (1957). J. Biol. Chem., 226, 497.
4. Bligh E. G., Dyer W. J. (1959). Can. j. Biochem. Physiol., 37, 911.
5. Kates M. (1972). Techniques of Lipidology. Elsevier, North-Holland.
6. Christie W. W. (1982). Lipid Analysis. Second Edition, Pergamon P ess.
7. Marinetti G. V. (1976). Lipid Chromatographic Analysis, Marcel Dekker.
8. Skipski V. P., Barclay М., Reichman E. S., Good J. J. (1967).
Biochhr.. Eio-phys. Acta, 137, 80.
9. Gonzalez-Sastre F. ,Folch-Pi J. (1968). J. Lipid Res., 9, 532.
10. Tolbert М. E. H" White A. C" Aspry K-, Cutts J., Fain J. N. (1980).
J. Biel. Chem., 255, 1938.
11. Grado C" Ballou С. E. (1961). J. Biol. Chem., 236, 54.
12. Tomlinson R. V., Ballou С. E. (1961). J. Biol. Chem., 236, 54.
13. Ellis R. B., Galliard Т., Hawthorne J. N. (1963). Biochem. J., 88,
125.
14. Downes C. P., Michell R. H. (1981). Biochem. J., 198, 133.
15. Irvine R. F., Brown K. D., Berridge M. J. (1984). Biochem. J., 221,
269.
16. Vaskovsky V. E., Kostevsky E. Y. (1968). J. Lipid Res., 9, 396.
17. Fiske С. H., Subbarrow Y. (1925). J. Biol. Chem., 66, 325.
18. Bartlett G. R. (1959). J. Biol. Chem., 234, 466.
19. Snyder F., Stephens N. (1959). Biochim. Biophys. Acta, 34, 244.
20. Duncombe W. G. (1965). Biochem. J., 88, 7.
21. Etamadi A.-H. (1980). Biochim. Biophys. Acta, 604, 423.
22. Op den Kamp J. A. F. (1979). Annu. Rev. Biochem., 48, 47.
23. Van Deenen L. L. M. (1981). FEBS Lett., 123, 3.
24. Kreibich G" Debey P., Sabatini D. D. (1973). J. Cell Biol., 58, 436.
25. Arion W. L, Balias L. М., Lange A. J., Wallin В. K. (1976). J. Biol.
Chem., 251, 4901.
26. Polokoff М.. Bell R. M. (1978). J. Biol. Chem., 253, 7173.
27. Higgins J. A., Evans W. H. (1978). Biochem. J., 174, 563.
28. Higgins J. A. (1984). Biochem. J., 219, 261.
29. Fujiki Y., Hubbard A. L., Fowler S., Lazarow P. B. (1982). J.
Cell Biol.,
93, 97.
30. Higgins J. A., Hutson J. L. (1984). J. Lipid Res., 25, 1295.
31. van den Bosch H. (1982). In: Phospholipids. Hawthorne J. N.,
Ansell G. B.
(eds.), Elsevier Biomedical, Amsterdam/New York/London, p. 313.
32. Westerman L, Kamp H. H" Wirtz K. W. H. (1983). Methods Enzymol., 98,
581.
13*
ГЛАВА 5
