Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
где ФХнар-микро - количество фосфатидилхолина в наружном слое мембраны
микросом.
Удельная радиоактивность липссомного фосфатидилхолина составляет 2/з от
удельной радиоактивности фосфатидилхолина в наружном слое мембраны
микросом при равновесии, а удельная радиоактивность фосфатидилхолина во
внутреннем слое остается такой же, как и в исходных микросомах.
Экспериментально измеренная удельная радиоактивность должна
согласовываться с расчетной величиной, полученной из доли
фосфатидилхолина в наружном слое микросомной мембраны.
Эксперименты, проведенные с ЛПБ, показали, что весь фосфатидилхолин в
микросомах печени крысы доступен для обмена. По-видимому, это связано с
трансмембранным переносом фосфатидилхолина, что делает метод ЛПБ
непригодным в случае микросом. С другой стороны, ЛПБ с успехом
использовались для изучения мембраны эритроцитов и в принципе могут
Перенесенная
метка
(расп./мин)
ФХ-липо
ФХ-ЛИПО+ФХнар-МИКрО
ФХнар-микро Общая метка
ФХ-микро (расп./мин),
192
Глава 4
применяться при изучении других мембран с помощью методик, подобных
описанным в этом разделе.
При исследовании трансмембранного распределения фосфолипидов необходимо
показать, что мембранные везикулы остаются замкнутыми в ходе
эксперимента. Важно также убедиться, что донорные и акцепторные мембраны
можно разделить после проведения обмена. Липосомы имеют тенденцию
прилипать к мембранным везикулам. Чтобы удостовериться в том, что этого
не происходит, проводят контрольный эксперимент, при котором оба типа
мембран метят необменивающимися маркерами. Подходящим маркером для
липосом является [14С]-хо-лестерололеат, а микросомы и другие клеточные
мембраны метят [3Н]-лейцином, вводя его животным либо незадолго до
умерщвления (за 30 мин), чтобы пометить секретируемые белки, либо
значительно раньше (за 24 ч), чтобы пометить мембранные белки. С помощью
этих меток можно определить степень взаимного загрязнения липосом и
мембран в ходе эксперимента.
9. Изучение биосинтеза, круговорота и внутриклеточного транспорта
мембранных фосфолипидов
В предыдущих разделах описаны экспериментальные методы, которые можно
применить также для исследований биосинтеза мембранных липидов и их
внутриклеточного транспорта. Для этого радиоактивно меченные
предшественники мембранных фосфолипидов включают in vivo или in vitro в
импульсном режиме или в импульсном эксперименте с вытеснением метки.
Затем определяют кинетику появления новосинтезированных фосфолипидов в
апикальной области клетки либо на поверхности мембраны, обращенной внутрь
цистерн или в цитоплазму.
9.1. Включение меченых предшественников в фосфолипиды
В условиях in vivo меченые предшественники включаются в мембранные липиды
так, как это описано в табл. 4.2. В экспериментах с вытеснением метки для
разбавления радиоактивного предшественника проводят повторную инъекцию
немеченого предшественника. Это особенно важно, если меченый
предшественник образует медленно метаболизирующийся пул в исследуемых
клетках.
В экспериментах in vitro метка включается главным образом в
эндоплазматический ретикулум (выделяемый как фракция микросом; гл. 1),
который является основным местом синтеза мембранных липидов в
гепатоцитах; впрочем, недавние исследования показали, что биосинтез
фосфолипидов осуществляется
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
193
в какой-то мере и в других мембранных органеллах. Ясно, что радиоактивные
предшественники фосфолипидов можно включить in vitro в те мембраны,
которые содержат соответствующую ферментативную активность.
9.1.1. Включение цитидиндифосфохолина и цитидиндифосфоэтаноламина в
фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин
Инкубируют мембраны (до 11 мг по белку) с цитидиндифос-фо[14С]-холином
или цитидиндифосфо[14С]-этаноламином (0,8 М, удельная радиоактивность ~
106 расп./мин на мкмоль) в 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем
0,87%-ный NaCI, 1 мМ ЭГТА и 15 мМ MgCl2.
9.1.2. Включение метильных групп из 5-аденозилметионина в
фосфатидилхолин
Метальные группы переносятся от S-аденозил [14С]-метионина на
фосфатидилэтаноламин. Катализируются ли все три стадии метилирования
одним или двумя ферментами, пока неясно. Чтобы осуществить синтез
фосфатидилхолина по этому пути в оптимальных условиях, следует
проинкубировать мембраны (до 5 мг по белку) с 1 мМ S-аденозил[14С]-
метилметионином (удельная радиоактивность 106 расп./мин на 1 мкмоль) в 50
мМ трис-НС1, pH 8,5, содержащем 0,87%-ный NaCI и 10 мМ MgCI2.
9.1.3. Включение азотистных оснований в фосфолипиды в ходе реакции
обмена
Мембраны эндоплазматического ретикулума содержат ферменты, которые
катализируют обмен основаниями, находящимися в составе фосфолипидных
молекул и содержащимися в инкубационной среде. Роль этих ферментов in
vivo пока не выяснена. Эту реакцию можно использовать, чтобы пометить
мембранные фосфолипиды с целью последующего изучения их миграции в
бислое.
1. Инкубируют микросомы (2-3 мг по белку) с 0,75 мМ [14С]-основанием
