Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 86

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 80 81 82 83 84 85 < 86 > 87 88 89 90 91 92 .. 191 >> Следующая

стерильных условиях.
фосфатидилэтаноламин, были выделены из цитозоля печени быка [32]. Выбор
того или иного ЛПБ в качестве мембранного зонда зависит от используемой
системы донор - акцептор.
8.3. Акцепторные мембраны
При исследовании мембранных липидов в качестве акцептора берут липосомы,
приготовленные из чистых фосфолипидов, липопротеины плазмы крови и
природные мембраны, например мембраны эритроцитов и митохондрий.
Единственное ограничение при выборе акцепторной мембраны состоит в том,
что ее нужно иметь в концентрации, достаточной для обеспечения 10-
кратного избытка по отношению к фосфолипидам донорной мембраны, при этом
донорные и акцепторные мембраны должны легко разделяться с количественным
выходом.
8.4. Радиоактивное мечение донорной мембраны
Мембранные фосфолипиды метят путем внутрибрюшинной илн внутривенной
инъекции радиоактивно меченного предшественника, осуществляемой перед
умерщвлением животного. Некоторые условия мечения микросом печени
приведены в табл. 4.2. Аналогично можно пометить и другие мембраны.
Степень включения в них предшественника определяют в ходе предварительных
экспериментов, проведя экстракцию фосфолипидов и их
190
Глава 4
анализ. Ниже описана методика определения доступного фос-фатпднлхолина в
микросомной мембране, использованной в дальнейшем в опытах по обмену
фосфолипидами с липосома-мн. В принципе эта методика пригодна для других
мембран и других фосфолипидов при условии, что проведены необходимые
контрольные эксперименты.
8.5. Приготовление липосом
1. С помощью пипетки вносят раствор фосфатидилхолина в органическом
растворителе, содержащий 2% фосфатндной кислоты, в толстостенную пробирку
или флакон. Испаряют растворитель, вращая пробирку, чтобы дать
возможность липиду распределиться в виде тонкой пленки по стенкам сосуда.
2. Добавляют раствор, содержащий 0,25 М сахарозу, 0,01 М трнс-буфер,
0,001 М ЭДТА, pH 7,4, и обрабатывают смесь в течение 10 мнн ультразвуком
с помощью диспергатора М. S. Е. при уровне мощности 5. Во время этой
процедуры пробирка должна быть погружена в лед. Количество используемого
фосфолипида н объем буфера зависят от условий эксперимента (см. ниже).
3. Обрабатывают смесь с помощью ультразвука, центрифугируют в течение 90
мин при 105 000 g, чтобы осадить недис-пергированные липиды, и отбирают
верхние три четверти надосадочной жидкости. Пробы супернатанта
экстрагируют смесью хлороформ/метанол (2:1) и определяют содержание
фосфолипидов, как описано выше.
4. Инкубируют радиоактивно меченные микросомы, содержащие 0,5-1,0 мг
фосфатидилхолина (3-5 мг микросомного белка), с липосомами (5-10 мг
фосфатидилхолина) в конечном объеме 1,0 мл среды, содержащей 0,25 М
сахарозу, 0,01 М трис-буфер и 0,001 М ЭДТА (pH 7,4), в присутствии ЛПБ и
без него в течение различных интервалов времени при 25 °С. После
инкубации осторожно наслаивают микросомную суспензию поверх 0,75 М
раствора сахарозы (9,0 мл) в центрифужных пробирках и центрифугируют при
105 000 g в течение 90 мин. Микросомы осаждаются, а липосомы остаются в
надосадочной жидкости.
5. Экстрагируют липиды как из липосом, так и из микросом, разделяют их с
помощью ТСХ и элюируют фосфатидилхолин. Отбирают пробы для определения
липидного фосфора и радиоактивности. Исходя из этих данных рассчитывают
долю меченого фосфолипида, перенесенного из микросом в липосомы, и
удельную радиоактивность фосфатидилхолина (в расп./мин на мкмоль липида).
Обмен фосфатидилхолина между липосомами и микросома-мн регистрируют по
переносу метки из одной мембранной фрак-
Разделение п анализ липидных компонентов мембран
191
ции в другую, а также по уменьшению удельной радиоактивности изучаемого
липида в микросомах и увеличению ее в лнпосомах. В условиях, описанных
выше, обмен обычно завершается в течение часа. Но в целом длительность
инкубации зависит от активности препарата ЛПБ. При этом необходимо
учесть, что микросомы не следует инкубировать более двух часов, поскольку
целостность их мембраны при более длительной инкубации нарушается. Чтобы
уменьшить время инкубации, следует увеличить концентрацию ЛПБ в
инкубационной среде.
В равновесии, т. е. по завершении процесса обмена, и при условии, что в
микросомах весь фосфатидилхолин доступен для обмена, а в липосомах - 2/з
его (это соответствует доле фосфатидилхолина на наружной стороне
липосом), выполняется соотношение
Перенесенная метка ФХ-липо___________________ Общая метка ,
(расп./мин) - фХ-липо+ФХ-.микро ' (расп./мин)
где ФХ-липо - обменный фонд фосфатидилхолина в липосомах (2/з его общего
содержания), ФХ-микро- суммарный микро-сомный фосфатидилхолин, общая
метка - исходная радиоактивность препарата микросом.
Если количество перенесенной метки меньше, чем ожидается при
исчерпывающем обмене, это означает, что доступен не весь микросомный
фосфатидилхолин и, следовательно, часть его находится на внутренней
стороне мембраны. Долю его можно рассчитать по формуле
Предыдущая << 1 .. 80 81 82 83 84 85 < 86 > 87 88 89 90 91 92 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed