Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 85

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 79 80 81 82 83 84 < 85 > 86 87 88 89 90 91 .. 191 >> Следующая

2. Добавляют ТНБС до конечной концентрации 3,0 мМ. В диапазоне
концентраций ТНБС от 1 до 12 мМ при количестве мембранного белка 8 мг
получаются одинаковые результаты.
3. Инкубируют смесь в течение разных промежутков времени при 7 °С,
комнатной температуре и 37 °С. Скорость модификации мембранных
фосфолипидов увеличивается с ростом температуры, но конечная степень
модификации остается той же самой. В некоторых экспериментах (например, с
целыми клетками) инкубацию необходимо проводить при низких температурах,
чтобы предотвратить проникновение ТНБС внутрь клеток.
4. Останавливают реакцию добавлением 1 мл 30% -ной ТХУ. Осаждают
денатурированные мембраны с помощью настольной центрифуги н
ресуспендируют осадок в 1 мл метанола. Добавляют 8 мл смеси
хлороформ/метанол/концентрированная НС1 (2:1:0,01, о/о). Оставляют
экстракт на 30 мин и добавляют 2,0 мл 0,02 М KCI в 0,1 М НС1 для
разделения его на две фазы. Отбрасывают верхнюю фазу, а нижнюю промывают
2,0 мл 0,2 М КС1 в 0,1 М НС1 и упаривают в вакууме или в потоке азота.
Разделяют фосфолипиды с помощью ТСХ в системе хлороформ/метанол/ледяная
уксусная кислота/вода (60:50:1:4). Модифицированные фосфолипиды имеют
желтую окраску и их можно пометить на пластинках перед обнаружением
непрореагировавших аминофосфолипидов с помощью нингидрина. Значения Ri
для липидов примерно равны: тринитрофенилфосфати-дилэтаноламин 0,86;
фосфатидилэтаноламин 0,65; тринитрофе-нилфосфатиднлсерин 0,6;
фосфатидилсерин 0,55.
Соскабливают пятна силикагеля, содержащие фосфолипид, и определяют
липидный фосфор. Рассчитывают долю модифицированных фосфолипидов по
формуле:
Липидный фосфор модифицированных фосфолипидов_____________ JQQ
Суммарный липидный фосфор модифицированных и немодифицпро-ванных
фосфолипидов
188
Глава 4
Суммарное содержание фосфора в модифицированных и не-модифицированных
фосфолипидах данного вида должно быть равно содержанию фосфора в этих
фосфолипидах в контрольных микросомах, проинкубированных без ТНБС. Доля
фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина, вступивших в реакцию с ТНБС в
замкнутых везикулах, отвечает относительному содержанию этих фосфолипидов
на наружной стороне мембраны.
Следует провести также контрольные эксперименты с использованием
незамкнутых микросомных везикул, в которых все аминофосфолипиды должны
прореагировать с ТНБС. В микросомах с ТНБС реагируют около 30%
аминофосфолнпидов, а в незамкнутых везикулах - более 90%.
8. Выяснение трансмембранного распределения фосфолипидов с помощью
фосфолипидобменивающих белков
8.1. Принцип метода
Фосфолипидобменивающие, или липидпереносящие, белки (ЛПБ) ускоряют обмен
фосфолипидными молекулами между мембранами, липопротеинами и липосомами.
Эти белки выделены из нескольких тканей, включая печень, сердце и мозг.
Механизм функционирования ЛПБ окончательно не установлен, однако имеются
данные о том, что in vivo они обеспечивают перенос, а не обмен
фосфолипидов между мембранами и поэтому могут играть важную роль в
биогенезе н обновлении мембран в клетке. In vitro ЛПБ осуществляют обмен
(молекула на молекулу) фосфолипидов, находящихся на наружной стороне
мембран. In vivo эти белки, по-видимому, функционируют, не изменяя
структуру мембран, поэтому они могут служить уникальным инструментом для
выяснения трансмембранного распределения фосфолипидов.
Исследуемые мембраны, меченные радиоактивным фосфолипидом (донорные
мембраны), инкубируют с избытком других мембран или каких-либо
фосфолипидсодержащих структур (акцепторов) в присутствии ЛПБ. Затем эти
мембраны разделяют и оценивают долю метки, перенесенной от донора к
акцептору, а также удельную радиоактивность фосфолипидов. Используя эти
оценки и зная содержание данного фосфолипида в мембране, можно
рассчитать, какая часть его доступна для обмена и, следовательно,
находится на наружной стороне мембраны.
8.2. Белки, участвующие в обмене фосфолипидов
ЛПБ, специфичные для фосфатидилхолина и фосфатидил-инозитола, и
неспецифичный ЛПБ, который способен переносить
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
189
Таблица 4.2. Включение метки в микросоыные фосфолипиды
Меченый фосфолипид Изотоп и удельная радиоактивность, мкКи/100 г1)
Время от момента инъекции до приготовления микро-соя. ч
Все фосфолипиды [32Р]-фосфат натрия 500-1000 16
Г тицерофосфолипиды Г'4С]- или [3Н]-глнцерол 5-20 1-16
Фо сфатидилхолин Г14С]- или [3Н]-ХОЛИИ2) 5-20 16
[14С]- или [3Н]-(метил) метионин 5-20 1-16
Фосфатидилэтаноламин [14С] - или [3Н] -этанол-амин2' 5-20 16
Фосфатндилинозитол Г14С] - ИЛИ pH] -миоинозитол3' 5-20 1-16
1) Внутрибрюшинная или внутривенная инъекция.
2) Поскольку азотистые основания включаются вначале в фосфолипиды
наружной стороны мембраны, необходимо какое-то время для равномерного
распределения метки между наружной и внутренней сторонами мембраны.
3) Миоинозитол подвержен бактериальной деградации, поэтому его растворы
следует готовить на стерилизованной воде н отбирать их для инъекции в
Предыдущая << 1 .. 79 80 81 82 83 84 < 85 > 86 87 88 89 90 91 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed