Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
только от изолированных клеток, но и от целых организмов. Например, у
шисгосом, червей класса трематод, они отделяются от поверхности
тегумента; этот процесс ускоряется при механическом воздействии
(например, при встряхивании червей) [20].
Чтобы выделить образовавшиеся таким образом везикулы, нужно отделить
продуцирующие их клетки или организмы осаждением или центрифугированием
при низкой скорости (например, 500 g в течение 2 мин) и собрать
супернатант.
2.1.2. Адсорбция на твердых поверхностях
Этот способ быстрого выделения плазматических мембран из клеток позволяет
обойтись без фракционирования клетки. Методика в общих чертах описана в
табл. 1.1, а иллюстрирует ее рис. 1.1. С помощью этого метода обычно
получают мембраны эритроцитов, клеток гепатомы и HeLa [21-24], однако
потенциальные возможности метода гораздо шире. Первые опыты с
эритроцитами показали, что плазматические мембраны, сорбированные на
отрицательно заряженных сферических гранулах и остающиеся на них после
отмывания клеток и их обломков, обращены в среду цитоплазматической
стороной. Однако необхо-
Органеллы и мембраны животной клетки
15
Таблица 1.1. Выделение мембран с помощью сферических гранул, покрытых
полил изином1)
1. Обрабатывают шарики Bio-Gel Р-2 полилизином (мол. масса 84-91 кДа,
Miles Laboratories) пли полиэтиленимином (мол. масса 50-100 кДа.
Polyscience), как описано в работе [24]. Можно использовать также
покрытые полилнзнном шарики Biorad Cytodex 1 Beads (Pharmacia).
2. Прикрепляют клетки к шарикам. Для этого пять раз промывают шарики ( -
0,5 мл) десятью объемами 0,15 М трпс-буфера, pH 7,4 (осаждают
центрифугированием). и четыре раза - раствором, содержащим 0,14 М
сорбитол, 20 мМ ацетат, pH 5,0 (буфер 1). Добавляют шарики,
суспендированные в 5 мл буфера 1, к равному объему клеток, также
суспендированных в буфере 1. Оставляют иа 10 мин при 4°С в центрифужной
пробирке, аккуратно ее переворачивая, чтобы происходило постоянное
перемешивание.
3. Доводят объем содержимого пробирки буфером 1 примерно до 50 мл и ждут,
пока шарики осядут; удаляют супернатант. Промывают шарики еще два раза,
чтобы удалить неприкрепившиеся клетки.
4. В течение 5-10 с сильно встряхивают пробирку на вортексе, добавляют
охлажденный во льду 10 мМ трис-НС1, pH 7,4 (буфер 2), и перемешивают
содержимое, переворачивая пробирку. Затем четыре раза промывают шарики
буфером 2, чтобы освободиться от клеток. Число прикрепившихся клеток
можно оценить с помощью сканирующей электронной микроскопии; если целые
клетки все еще остаются на шариках, необходимо промыть их еще несколько
раз.
5. После окончательной промывки суспендируют покрытые мембранами шарики в
буфере 2 и обрабатывают ультразвуком при 20 Вт (илн менее) в течение 5 с.
Затем трижды промывают шарики буфером 2. Теперь их можно использовать для
биохимического анализа прикрепленных мембран.
') Из работы (211: см. рис. I.I.
димо иметь в виду, что плазматическая мембрана клеток, содержащих ядро,
имеет тенденцию к образованию везикул с правильной ориентацией
(невывернутые везикулы). Сорбированные на сферических гранулах мембраны
можно подвергнуть прямому ферментативному и химическому анализу;
десорбция же мембран возможна только под действием детергентов или при
экстремальных значениях pH, а это может привести к нарушению
биологической активности.
Помимо гранул, покрытых полилизином, используют и другие твердые
носители. Например, с помощью гранул сефадекса, обработанных
нитроцеллюлозой, получали плазматические мембраны из L-,клеток мыши [25],
нейлоновые волокна (Baxter-Tra-venol Labs, Deerfield, 60015, USA)
применяли для выделения плазматических мембран перитонеальных лейкоцитов
[26], коллоидный силикон - для выделения плазматических мембран
Dictiostelium [27], сефарозные гранулы, на поверхности которых
фиксированы различные лектины,- для получения плазматических мембран
эритроцитов [28] и клеток лимфомы мышей [6]. Биологическую специфичность
этого метода можно повысить, модифицируя поверхность твердых носителей с
помощью антител; иммуноадсорбцион.ный метод выделения клеточных мембран
описан в гл. 3.
Таблица 1.2. Методы разрушения клеток в составе тканей
Аппарат
Гомогенизаторы
Даунса
Гомогенизаторы Поттера - Элвехейма
Polytron, Ultraturrax
"Азотные бомбы"
Насосы
Прессы
Замечания по использованию
Широко применяются. Имеют разный рабочий объем (3-30 мл), плотно
притертый (зазор 0,07 мм) или слабо притертый пестик. Движение пестика
осуществляется вручную, поэтому возникающие сдвиговые силы невелики.
Гомогенизаторы с плотно притертыми пестиками пригодны для гомогенизации
культивируемых клеток, набухших в гипотонической среде.
Широко применяются. Имеют разный рабочий объем (5-50 мл). Требуют
использования моторов с большим числом оборотов. Выпускаются модели с
водяным охлаждением (В. Braun, МеГ singer, FRG). Зазор обычно составляет
0,10- 0,23 мм, но может быть и больше, если пестик изготовлен из тефлона.
